银川地区鸡源沙门菌血清型鉴定及耐药性分析



银川地区鸡源沙门菌血清型鉴定及耐药性分析

王艺晖，曹思婷，柴慧敏，李小龙，白洋，丁剑锋，王桂琴*

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

摘要：为了解银川地区鸡源沙门菌的耐药性及优势血清型，采用药敏纸片扩散法测定了69株鸡源沙门菌对常用12种抗菌药物的耐药率，同时采用玻板凝集法对沙门菌进行了血清型鉴定。结果显示,所有菌株对12种抗菌药物均产生了不同程度的耐药性，其中对萘啶酸、复方新诺明、氨苄西林、头孢唑啉的耐药率较高；对美洛培南、环丙沙星的耐药菌株比率较低；多重耐药情况比较严重，部分菌株同时具有对12种抗菌药物的耐药性，具有5重耐药能力的菌株占21.74%。分离到的菌株中主要血清型为鸡白痢沙门菌(S.gallinarum)，其次为鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)和伤寒沙门菌(S.typhi)。

关键词：鸡;沙门菌;耐药性;血清型

沙门菌在自然界分布广泛，血清型众多，目前已知的沙门菌约有2 535个血清型，46个血清组。国内鉴定出的约有300种血清型，分属37个血清组[1-2]。沙门菌感染是世界范围内重要的公共健康问题之一[3]。在我国，沙门菌导致的食物中毒位居食物中毒案例的首位[4]。

鸡感染沙门菌可引起鸡白痢、鸡伤寒和副伤寒等鸡沙门菌病。沙门菌可以通过水平传播在蛋鸡群中传播，导致产蛋量及蛋品质下降；或垂直传播(经卵传播)引起雏鸡先天带菌等问题。近十几年来，鸡沙门菌感染引起的蛋鸡产蛋率下降和蛋、肉产品污染等问题在我国表现的越来越明显，给养禽业带了巨大的损失。同时，沙门菌也能感染人，引起腹泻、呕吐、败血症等，严重影响人的健康。本试验对银川69株鸡源沙门菌进行了血清型鉴定，并对其进行了耐药性分析，以了解宁夏银川地区临床分离的鸡源沙门菌流行情况及耐药现状，对于合理选择和使用抗菌药物，以及耐药性监测工作的开展具有重要的指导意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株沙门菌分离自银川地区贺兰金伯爵屠宰场、永宁三场和恒泰源鸡场的健康鸡的泄殖腔及盲肠；质控菌株大肠埃希菌ATCC25922购自中国药品与生物制品检定所。

1.1.2抗菌药物药敏纸片庆大霉素、环丙沙星、氨苄西林、头孢曲松、多西环素、阿莫西林、萘啶酸、新诺明、美洛培南、头孢噻呋、头孢唑啉均购自英国Oxoid Limited公司。

1.1.3主要培养基及试剂MH琼脂、SC培养基、BHI脑心浸液培养基、营养肉汤购自北京奥博星生物技术有限公司；沙门菌CHRO Magar显色培养基购自郑州博赛生物技术研究所(法国科玛嘉公司中国地区总代理)；沙门菌标准血清(60种)购自宁波天润生物药业有限公司。

1.1.4主要仪器设备超净工作台；电热恒温培养箱；压力蒸汽灭菌器；PCR仪；电子天平司。凝胶成像系统和电泳成套设备；微量可调加样器。

1.2方法

1.2.1采样灭菌棉签蘸取鸡泄殖腔内容物，置灭菌肉汤中培养；或无菌取2日龄～3日龄雏鸡盲肠一段放入增菌液中，4 h内送回实验室进行处理。

1.2.2细菌的初步鉴定将拭子或截取的部分盲肠放入SC增菌液中，37℃培养16 h～24 h，取菌液划线接种于SS琼脂和沙门菌显色培养基，置37℃恒温箱培养24 h～48 h，观察菌落形态特征，并进行革兰染色镜检。

1.2.3沙门菌PCR鉴定参照文献[5]设计引物，引物序列为16 S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16 S-R：ACGGCTACCTTGTTACGA- CTT，引物由上海英潍捷基有限公司合成。对所有初步鉴定疑似为沙门菌的菌株进行PCR 鉴定。 PCR模板制备：水煮法提取细菌DNA。 PCR反应体系:2×TaqPCR Master Mix 10 μL, 上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 20 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共循环30次；最后72℃ 5 min。反应结束后取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。目的片段为1 300 bp，切胶将其回收后送上海英潍捷基公司测序。

1.2.4沙门菌体外抑菌试验按CLSI[6]推荐的纸片法进行，以ATCC25922作为质控菌。试验结果判定按照美国临床检验标准委员会(CLSI)制定的标准进行。

1.2.5沙门菌血清型鉴定沙门菌属血清(60 种)鉴定参照沙门菌血清型鉴定方法说明书进行。被检菌首先用O多价及O复合和O单因子血清鉴定其O抗原，必要时以Vi血清鉴定其Vi抗原，然后以H多价及H复合和H单因子血清鉴定其H抗原， 根据Kauffmann-White抗原表检索沙门菌的血清型[7]。 具体操作方法为用接种环于洁净玻片上滴1滴～2滴血清，然后取少量被检菌苔与血清混匀，轻轻摇动玻片。同时，在玻片的另一区域取少量被检菌苔与生理盐水混匀作对照。1 min内进行观察。呈凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。

2结果

2.1沙门菌的鉴定结果

在沙门菌显色培养基上呈圆形、微凸、边缘整齐、紫色，直径1 mm～2 mm的小菌落。在SS培养基上无色透明，有黑色中心。沙门菌镜检为革兰阴性、两端钝圆的短杆菌，无芽胞，散在或成对。经过PCR方法共鉴定出69株鸡源沙门菌(图1)。

2.2沙门菌的血清型鉴定结果

69株沙门菌中有63株鉴定出了血清型，6株未

能确定，优势血清型为鸡白痢沙门菌(S.gallinarum)，共27株，鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium) 14株，伤寒沙门菌(S.typhi) 9株，德比沙门菌(S.derby) 8株和塔克松尼沙门菌(S.taksony)5株。

M.DNA标准DL 2 000；1～12.疑似沙门菌菌株

2.3沙门菌对12种抗菌药物的敏感性

分离菌对美洛培南、和环丙沙星的敏感率最高，耐药菌株比例最高的是萘啶酸(92.8%)，其次对复方新诺明、氨苄西林、头孢唑啉具有耐药性的菌株，达到50%以上，对头孢曲松、庆大霉素等药物的耐药菌株比例也达到40%左右(表1)。

2.4沙门菌对12种抗菌药物耐药谱型分析

69株沙门菌对12种抗菌药物的耐药谱情况见表2，其中有5株菌株对12种抗菌药物均敏感。

2.5沙门菌多重耐药分析

69株分离菌株中，有5株菌对12种药物均敏感，其余菌株有不同程度的耐药性，其中5重药物耐药的菌株最多，占21.7%。其次为9重、8重和7重耐药菌株，比例分别为12%、10%和9%。1株分离菌具有12重耐药能力。参照多重耐药标准同时对3种药物具备耐药性，即可归为多药耐药， 69株分离沙门菌菌株中具有多重耐药能力的菌株占72.5%(图2)。

表1　69株沙门菌对12种抗菌药物的耐药率

表2　64 株沙门菌对12种抗菌药物的耐药谱

注：NA为萘啶酸；CRO为头孢曲松；CN为庆大霉素；KZ为头孢唑林；AMP为氨苄西林；STX为复方新诺明； DO为多西环素；EFT为头孢噻呋；AMC为阿莫西林； CIP为环丙沙星；MEM为美罗培南。

Note:NA means nalidixic acid；CRO means ceftriaxone；CN means gentamicin；KZ means cephazolin；AMP means ampicillin；STX means sulfamethoxydiazine； DO means doxycycline；EFT means ceftiofur；AMC means amoxicillin； CIP means ciprofloxacin；MEM means meropenem.

3讨论

3.1沙门菌的耐药率情况

根据对宁夏银川地区鸡场分离出的沙门菌进行的药敏试验分析可知，该地区沙门菌耐药现象普遍比较严重。在本次分离出的沙门菌对萘啶酸、氨苄西林的耐药性最为严重，对比诸葛石养等[8]对广西分离到的158株鸡源沙门菌的研究结果，其分离株对萘啶酸、氨苄西林均严重耐药，耐药率均达到80%以上，这与本试验结果相似，说明不同地区使用抗菌药物种类、方式、数量相似，其耐药性的发生率也会比较接近。本试验中，沙门菌对氨苄西林的耐药率为63.8%，比郭琍等[9]报道的100%要低，这可

图2　沙门菌对12种抗菌药物多重耐药情况

能是由于菌种来源的不同以及人与动物使用青霉素类药物的种类和频率不同造成。通常细菌的耐药性可以过食物链传播给人类[10-11]，动物源沙门菌新的耐药机制的出现，将对人源沙门菌耐药性产生一定的影响。所以在食用动物上正确的选择用药，对控制耐药菌株的传播有非常重要的意义。

3.2多重耐药情况分析

研究发现，从禽养殖场分离的沙门菌对大多数临床使用的抗菌药物已普遍产生耐药性，而且细菌的耐药率越来越高，对抗菌药物的交叉耐药现象越发严重，多重耐药感染日益增加，并且这样的情况在国内养殖场中非常普遍[12]。本次耐药性研究发现，沙门菌同时对喹诺酮类、青霉素类、头孢菌素类抗菌药物耐药的菌株达到72.5%，这与陈希文等[13]报道的研究结果一致。对5种抗菌药物耐药的菌株所占比例最大，占到21.7%,对10种以上抗菌药物耐药的菌株所占比例为7.3%，同时，有1株菌对12种药物全部耐药。通过本次研究验证了沙门菌对抗菌药物已产生了严重的多药耐药，合理使用抗菌药物是控制该菌耐药的关键。如对3种及3种以上药物同时耐药即可归为多重耐药，那么本次试验菌株的多重耐药率为72.5%。由此推断，细菌在药物的使用压力下能很快产生耐药性，使用抗菌药种类越多，产生的耐药谱就会越广,形成多重耐药,这与潘志明等[14]的研究结果相符。部分资料的研究结果显示[15-16]，耐药性不仅仅是反复用药的结果，也是沙门菌在不利环境中增强生存能力的自身防卫的结果，这也是沙门菌容易产生耐药性的原因。

3.3血清型鉴定分析

63株分离菌株中鸡沙门菌优势血清型为鸡白痢沙门菌(S.gallinarum)，共27株，14株为鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)，9株为伤寒沙门菌(S.typhi)。这与刘翔等[17]的研究结果有所差异。其中鼠伤寒沙门菌同为优势血清型，但其检出肠炎沙门菌的比例较多，说明不同地区来源的沙门菌血清型分布有较大差异。从病禽中分离到的沙门菌具有广泛的感染对象，但根据沙门菌生长环境和宿主的不同，其血清型差异较大[18-19]，如2006年食品检出沙门菌优势血清型在泰国为斯坦利沙门菌(S.stanley)，在日本为婴儿沙门菌(S.infantis)，在亚洲各国主要为鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、德比沙门菌、肠炎沙门菌等[20]。通过对银川地区沙门菌血清型的鉴定，为有效防治沙门菌病以及抗菌药物的选用具有重要的指导意义，也是调查银川地区沙门菌血清型分布的参考依据之一。

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动物医学进展,2015,36(11):121-124ProgressinVeterinaryMedicine

Serotype Identification and Drug Resistance Analysis ofSalmonellaIsolated

from Chicken in Yinchuan

WANG Yi-hui, CAO Si-ting, CHAI Hui-min, LI Xiao-long, BAI Yang, DING Jian-feng, WANG Gui-qin

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China)

Abstract:In order to know the serotype and antimicrobial resistance of Salmonella isolated from chicken in Yinchuan，the antimicrobial resistance of 69 Salmonella strains to 12 drugs were determined by the methods of disk diffusion and serotypes were tested using glass plate agglutination. The results showed that all 12 antibacterial agents had different degrees of resistances, which had a high resistance to nalidixic, sulfamethoxazole, ampicillin and cefazolin. The resistant rates were lower to meropenem, chloramphenicol and ciprofloxacin. The resistance was serious and all isolates tolerated up to 12 kinds of drugs. The main resistance spectrum was 5 kinds of drugs and accounted for 21.74%. The main serotypes were S. gallinarum, S. typhimurium and S.typhi.

Key words:chicken;Salmonella;antimicrobial resistance;serotype

文章编号:1007-5038(2015)11-0121-04

中图分类号:S852.612

文献标识码:B

作者简介：王艺晖(1991-)，女，宁夏银川人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究。 *

通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目( 31160519)

收稿日期：2015-04-10