五株鸡传染性支气管炎病毒流行株的分离鉴定

宋新宇+马爽+李陆梅+赵鹏+窦小龙+王红+范跟成

摘要：2012年1月-2014年8月，从全国多地出现传染性支气管炎发病养鸡场（户）中采集病（死）鸡气管、肾脏和腺胃进行流行病学调查。根据各地分离株与YB160株S1基因分子进化树分析，筛选出5个代表性的毒株，在SPF鸡胚中传至第5代，分别进行毒价测定、无菌检验及对SPF鸡的致病力研究。结果，所筛选出的5个流行株在SPF鸡胚传至第5代时，毒价均大于或等于106.1EID50/0.1 mL，菌检阴性，人工感染试验接种1日龄SPF鸡，可引起试验鸡出现典型传染性支气管炎症状。

关键词：鸡传染性支气管炎；分离鉴定；流行株；QX型

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6187-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.046

Abstract：From January， 2012 to April，2014，we did epidemiological investigation by collecting tracheas，kidneys and glandular stomachs of diseased chickens from emerged the infectious bronchitis disease chicken farms（households）. According to the analysis of local isolates and YB160 strains S1 gene molecular evolutionary tree，we sifted five representative strains. We spread the five strains to the fifth generation with SPF chicken embryo，then we did drug price determination，sterile inspection and the pathogenicity study of SPF chicken of each strain. In the results，we found that when the five strains spread to the fifth generation，drug prices were all higher than 106.1EID50/0.1 mL，sterile inspections were all negative，and artificial infections used 1 day-old SPF chicken could cause typical symptoms of infectious bronchitis.

Key words：Avian infectious bronchitis virus； isolation and identification； epidemic strain； QX type

鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由冠状病毒科（Coronavirdae）冠状病毒属（Coro-nav irus）的传染性支气管炎病毒（Infectious bron-chit is virus，IBV）引起的一种急性高度接触性传染性疫病[1，2]。自20世纪30年代在美国暴发以来，现已成为世界各地流行的重要禽病[2]。IBV是单股RNA病毒，该病毒基因可因点突变和重组而发生变异，故传染性支气管炎病毒血清型较多[2]。由于IBV的主要中和抗原表位和保护性表位主要由纤突蛋白（S 蛋白）的S1蛋白决定[2，3]，各血清型毒株之间的差异主要是S1基因变异造成的[4]，所以，针对S1基因的研究在IBV的流行病学研究中具有重要代表意义。

由于IBV疫苗的大量使用所带来的的免疫选择压力，大量的流行病学监测结果显示，近年来国内流行的IBV毒株处于持续不断的进化当中。QX型毒株是近十多年才开始流行的新的基因型，其原型株QXIBV最早由农业部动物检验所于1996年分离自青岛某发生腺胃炎的鸡群（动物回归试验未复制出腺胃炎病变）[5]，但直到2004年该型病毒才被证实在国内广泛流行，临床表现主要为肾病变和不同程度的腺胃病变；而包括俄罗斯、荷兰、比利时、德国、法国等在内的多个欧洲国家也在同一时期发现存在该型毒株的流行。根据韩宗玺等[6]对1995～2009年共计15年间国内可检索到S1基因全长序列的所有IBV分离株进行的遗传进化分析，结果显示国内至少同时流行10个以上基因型的IBV毒株，但QX型（也称LX4型）為最主要的优势基因型（54.1%）。根据最近的研究报道，在2009年以后国内分离株中，QX型毒株所占的比重至少在65%以上[7-10]。根据文献的报道，现有疫苗对QX型毒株交叉免疫保护性较低[11]，因此研制相应血清型的新型疫苗的需求日益迫切。

为满足市场需求，青岛易邦生物工程有限公司与普莱柯生物工程股份有限公司联合研制了鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota株+YB160株），为验证QX型IBV YB160株对当前流行株的交叉保护性，2012-2014年在各地区畜牧兽医站、动物检疫站和养殖场配合下进行IBV流行病学调查，根据各地分离株、经典疫苗株与YB160株S1基因分子进化树分析，从当前主要流行型中，筛选出临床发病较典型的5个有代表性的毒株CK/CH/SD/QD/2013/1株（简称“QD13株”）、CK/CH/SD/2013/2株（简称“SD2株”）、CK/CH/GD/2014/1株（简称“GD株”）、CK/CH/HLJ/2013/1株（简称“HLJ株”）及CK/CH/SX/2014/2（简称“SX株”）进行了分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 病料

病鸡气管、肾脏和腺胃组织，采自全国多地养鸡场（户）。

1.2 引物

参照GenBank收录的IBV S1基因序列保守区域设计，由上海英骏公司合成。上游引物IBV-87： 5′-TAT TGA TTA GAG ATG TTG GG-3′；下游引物S1 Oligo3′：5′-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3′。

1.3 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；AMV反转录酶、Taq DNA聚合酶及RNA酶抑制剂购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 病毒的分离 无菌采集发病鸡气管、肾脏和腺胃，用无菌生理盐水匀浆制成20%悬液，每毫升加入2 000 U青、链霉素，反复冻融3次，3 000 r/min离心15 min，取上清除菌后经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚，置37 ℃孵育观察，孵化144 h，收集鸡胚液。

1.4.2 分离病毒免疫原基因（S1）的RT-PCR扩增 取各组病料收获的感染鸡胚液进行S1基因的RT-PCR扩增，序列测定。并用MEGA5.05软件进行序列比较和分析。

1.4.3 鸡胚传代及毒价测定 根据分离病毒免疫原基因序列比较和分析结果，选取5株代表毒株，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种0.1 mL，37 ℃孵育，培养36 h。弃去24 h内死亡鸡胚，无菌收集鸡胚液。按此方法连续传代至第5代，并测定第5代的病毒含量。

1.4.4 无菌检验 取5株代表毒株连续传代至第5代，分别按2010年版《中国兽药典》附录进行检验。

1.4.5 分离病毒第5代对SPF鸡的致病力 ①人工感染试验。用5株代表毒株第5代毒分别滴鼻接种1日龄SPF鸡10只，104.0EID50/只，置负压隔离器内饲养观察14 d。②病理学观察。将人工感染试验病、死鸡剖检，观察病变。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

将无菌采集的病鸡气管、肾脏和腺胃制备20%的悬液，接种10日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2 mL，37 ℃孵化144 h，收集尿囊液并进行HA测定，同时观察鸡胚的变化。连续盲传3～5代，各代尿囊液HA效价呈阴性，接种后部分鸡胚出现早期死亡，死亡鸡胚全身出血明显，未死鸡胚发育受阻，呈明显的侏儒胚、蜷缩胚变化。

2.2 分离株S1基因RT-PCR扩增及分子进化树分析结果

分离株S1基因RT-PCR扩增均可见到清晰的1.7 kb左右大小的条带，与引物设计的预期结果相符。从进化树看，当前IBV主要流行QX型。序列比对结果见图1。

2.3 5株代表毒株的传代及毒价测定

QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株在SPF鸡胚中传至第5代，5株分离毒均可致鸡胚典型病变，死亡鸡胚全身出血明显，未死鸡胚可见发育受阻，呈明显的侏儒胚、蜷缩胚变化。分别取QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代毒种测定病毒含量，结果显示QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代病毒含量分别为106.3、106.1、106.3、106.3和106.1EID50/0.1 mL。

2.4 无菌检验

按2010年《中国兽药典》附录进行检验。结果5株分离毒均无菌生长，无菌检验合格。

2.5 对SPF鸡的致病力

2.5.1 人工感染试验 用分离病毒QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代各接种10只1日龄SPF鸡，104.0EID50/只。接种后3～5日，开始发病，病鸡精神沉郁、闭眼、羽毛蓬乱、采食和饮水急剧减少、拉黄白色或黄色或绿色稀便，伴有呼吸症状、呼吸有啰音。发病中后期消瘦衰竭死亡，在发病后5～7d处于死亡高峰，发病后期鸡只表现发育极不整齐，大小不均。5株病毒接种的SPF鸡发病率为80%～100%，死亡率为40%～60%（表1）。

2.5.2 病理观察 人工感染试验鸡的病理变化基本相同。剖检病鸡和死鸡，均极度消瘦，泄殖腔周围有粪便粘污；鸡肾脏肿大，有尿酸盐沉积，可见明显“花斑肾”；气管黏膜潮红或出血；个别鸡腺胃肿大。其他器官在肉眼上未见明显变化。

3 讨论

1）近年来国内流行的IBV毒株处于持续不断的进化当中。根据2012-2014年期间国内IBV流行病学调查结果，QX型已成为国内IBV主要流行基因型[13]。与Han等[6]、张小荣[12]报道的相一致。

2）2012-2014年间，我们进行IBV流行病学调查中共分离到69株IBV流行株。根据IBV S1基因的發表序列设计并合成一对可扩增IBV全长S1基因的寡核苷酸引物，两引物间跨度约1.7 kb。RT-PCR扩增分离毒S1基因获得了与预期大小相一致的目的条带，证明分离毒符合鸡传染性支气管炎病毒的特性。由于分离株太多，全部进行系统鉴定用时太长，故根据各地分离株、经典疫苗株与YB160株S1基因分子进化树分析，仅从当前主要流行型（QX型）中，筛选出5株分布在不同区域的（山东、广东、黑龙江及陕西）发病的临床较典型IBV，S1基因同源性有一定差异的代表性毒株进行系统鉴定，作为流行株免疫保护试验攻毒用毒株。

3）将这5株毒在SPF鸡胚中传至第5代后，毒价均可达106.1EID50及以上，人工感染试验接种1日龄SPF鸡，可引起试验鸡80%～100%发病，死亡率可达40%～60%。

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