重庆烟区硅酸盐细菌的分离鉴定及生理生化特性

杨笑笑　李振轮　王晗　李娜

摘要：采用土壤稀释平板法从重庆市彭水县的植烟土壤样品中分离出8株具有解钾能力的细菌，通过测定其对含钾矿石中有效钾的释放能力，筛选出两株具有较强的解钾能力的硅酸盐细菌，运用分子生物学方法对这两株硅酸盐细菌的16～23S rDNA序列进行扩增并鉴定。结果表明，一株细菌属于胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），另一株细菌属于短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis），并且研究了这两株细菌的生理生化特性。

关键词：硅酸盐细菌；分离鉴定；生理生化特性；重庆烟区

中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1013-04

土壤是一个天然钾库，每公顷土壤耕层含钾量约为26.1 t，而90%～98%以上的钾素存在于钾长石和云母等富含硅酸盐的矿物中，其中的钾素多以缓效态存在，不能直接被农作物利用，能被植物吸收利用的可溶性速效钾含量约占农作物总需求量的5%和土壤总钾量的0.1%～0.2% [1]。因此，我国土壤既富含钾又缺钾，总体呈现出可溶性速效钾素缺乏的现象。有关资料显示，中国的钾肥产量占世界的0.34%，而消耗量占14.7%，可见我国钾素资源短缺，多依赖于进口[2]。以多种形式补充土壤中的可溶性速效钾素，科学合理施用钾肥已成为农业生产中的主要技术措施之一[3]。发掘土壤中具有解钾能力的微生物，将其应用于可溶性速效钾素的释放，提高土壤中可利用钾素的含量，是近些年钾肥研究领域的热点。相关报道表明，解钾细菌多是硅酸盐细菌，它能够分解硅酸盐类矿物并协同释放出钾等元素供植物利用，将土壤矿物中缓效态钾素转化为可溶性速效钾素，兼具固氮、解磷功能[4]，并且该类细菌对营养成分要求不高，广泛分布于土壤中，是一种良好的功能菌[5]。因此，在化学钾肥供应不足的大环境下，以解钾菌的相关研究为基础，研发出效果好、成本低且环境友好的微生物肥料，进一步挖掘土壤中的钾素资源，具有重要的科学和实际意义。

近年来，对硅酸盐细菌解钾的研究，大致集中于4个方面[6] ： 一是解钾的效果研究；二是解钾的条件，包括土壤条件和环境条件的研究；三是解钾的机理研究；四是实际投入运用研究。硅酸盐细菌解钾的效果研究处于首要地位，即筛选出一些解钾能力较强的菌株，目前国内外的研究大都处于这一阶段。

我国西南地区是重要的农作物及经济作物产地，其地理位置、生态环境和土壤条件具有特殊性，土壤中矿物钾的含量丰富，但是可供植物直接利用的可溶性钾含量较低。本试验主要从重庆彭水县植烟区缺钾土壤中分离一些硅酸盐细菌，并对其中具有较高解钾能力的菌株进行分类鉴定，可为利用硅酸盐细菌增加重庆植烟区缺钾土壤中有效钾的含量提供微生物资源。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤样品采自重庆市彭水县植烟区。风干，过1 mm筛备用。

钾长石粉：经0.1 mol/L NH4Cl溶液清洗，阴干备用[7]。

白云母粉：过1 mm筛，阴干备用。

1.2 培养基

缺钾培养基A：蔗糖5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 1.0 g， Na2HPO4 2.0 g，FeCl3 0.005 g，钾长石粉 1.0 g，去离子水1 L[8]。

缺钾培养基B：蔗糖5.0 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，钾长石粉或白云母粉1.0 g，FeCl3 溶液数滴，去离子水 1 L，琼脂 20 g[9]。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 4.0 g，蛋白胨 10.0 g，去离子水1 L，pH 7.2～7.5。

无氮培养基：蔗糖 10.0 g，K2HPO2 2.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.5 g， CaCO3 0.5 g， 酵母膏 0.5 g，去离子水1 L，琼脂 15.0 g，pH 7.4[10]。

1.3 方法

1.3.1 解钾菌筛选与培养

1）土壤样品稀释。在无菌操作下称取10.0 g土壤样品，加入到含玻璃珠及90 mL无菌水的三角瓶中。置于摇床以200 r/min充分振荡30 min，即配制成10-1土壤稀释液。用无菌枪头吸取5.0 mL上述稀释液，加入到含45 mL无菌水的三角瓶中，混匀成10-2土壤稀释液。这样依次稀释，得到10-3土壤稀释液（每个稀释度须更换无菌枪头）。

2）推板筛选。选取10-2以及10-3稀释度的土壤稀释液，分别吸取200 ？滋L加入到缺钾培养基A中，进行平板涂抹，涂抹均匀后30 ℃培养3 d左右。挑取边缘整齐、湿润、黏稠、无色透明、富有弹性的菌落[10]，划线纯化。

挑取纯化后的单菌落加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃，160 r/min摇瓶扩大培养，分装添加适量甘油后低温保存。

1.3.2 解钾能力的测定 每250 mL三角瓶中加50 mL缺钾培养基B，添加不同类型的矿物（钾长石粉、白云母粉），121 ℃，20 min灭菌。加入3 mL菌悬液（OD600nm=1.0），分别设置20、25、30、35 ℃ 4个温度梯度， 3次重复，160 r/min摇床培养。培养6 d后取培养液用60 g/L稀H2O2消煮，过滤定容。采用火焰光度法测定速效钾的含量[11]。

1.3.3 细菌鉴定 根据解钾能力测定结果，选取解钾能力较好的细菌进行DNA序列扩增。采用细菌16～23S rDNA通用引物 16～23S（1）（5′- TTGT

ACACACCGCCCGTC-3′）， 16～23S（2）（5′-CCTTTCC

CTCACGGTACTG-3′），配置25 μL PCR反应体系：包括1×PCR缓冲液，0.625 U Taq酶，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer1， 0.4 μmol/L primer2，50～100ng /μL DNA模板稀释液。PCR扩增程序为95 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32个循环；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物割胶回收，经TA克隆后送至英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。

1.3.4 生理生化特性测定 采用革兰氏染色法，并以无氮培养基为基础，进行葡萄糖、明胶等生理生化特性测定和一些生物学特性测定，具体方法参见《常见细菌系统鉴定手册》[12]。

2 结果与分析

2.1 解钾菌筛选结果

经过土壤样品稀释涂平板，在分离培养基的平板上可观察到圆形、表面光滑且透明、凸起、有弹性的菌落，培养3～5 d后菌落直径约为7～9 mm。由于多数的解钾菌在具有解钾能力的同时具有固氮能力，所以在菌株的选择上，以能否产荚膜作为一个筛选条件 [4] 。挑取符合上述形态的菌株在无氮培养基上进行划线纯化，然后通过荚膜染色，选择有荚膜的菌株，分别命名为K1～K8。

2.2 解钾菌K1～K8对钾长石和白云母的解钾作用

将解钾细菌k1～k8接种于缺钾液体培养基B（分别含钾长石和白云母），分别置于20、25、30、35 ℃摇瓶培养，培养6 d，测定其速效钾的含量，结果见图1和图2。由图1可知，K2与其他菌株相比，在20、30 ℃条件下解钾能力最强，速效钾的含量分别比对照增加了近80%和100%，且K2在20 ℃条件下解钾能力强于其他温度。由图2可知，在20 ℃条件下K6解钾能力强于其他温度，且其在20、30、35 ℃条件下的解钾能力强于其他菌株，速效钾的含量分别比对照增加了133%、100%、125%。同时，由图2可知，K2在25 ℃条件下对白云母粉的解钾能力强于其他温度，这与图1中K2对钾长石粉的解钾能力随温度的变化不同。图1与图2相比较可知，细菌K1～K8对白云母粉的解钾能力均高于对钾长石粉的解钾能力。

2.3 解钾细菌的分子生物学鉴定及生理生化特性

2.3.1 菌株K2和K6的鉴定结果 对解钾能力较强的细菌K2和K6进行分子生物学鉴定。PCR扩增结果表明，K2扩增出长约1 000 bp DNA片段，K6扩增出长约900 bp DNA片段（图3）。将测序结果与NCBI数据库中已报道的菌种进行BLAST比对，结果显示K2与短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis NBRC 100599 DHA）（登录号：AP008955.1）相似度达99%，K6与胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus K02）（登录号：CP003422.1）相似度达99%。可据此判定K2属于短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis），K6属于胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）。

2.3.2 生理生化特性 K2生理生化特性符合短芽孢杆菌属（Brevibacillus Shida）的特性，K6的生理生化特性也符合芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）的特性（表1），即从生理生化的角度对分子生物学鉴定结果进行了验证。

3 讨论

近年来，硅酸盐细菌在农业生产中潜在的应用前景逐渐为人们所了解，并将应用到微生物肥料中，表明硅酸盐细菌具有良好的发展前景。

蒋先军等[13]认为，硅酸盐细菌的增产作用不应只从它能分解硅酸盐矿物释放出钾来考虑，还应考虑到硅酸盐细菌作为一种根际微生物在植物微生物系统中的作用及自身产生的各种作用，如影响植物营养的有效吸收和植物病原物的活动，以及代谢产物对植株生长的影响等。同时，王思远[14]研究表明，硅酸盐细菌能明显地促进土壤养分的转化，促进烟株对养分的吸收利用和生长发育，配合一定量的氮、磷、钾化肥施用效果更好，能明显地促进烟株的生长发育。盛下放等[15]研究表明，硅酸盐菌剂不仅可以促进棉花生长，提高其产量和品质，而且可以降低生产成本，保护生态环境。因此，从生态角度上，开发以具有解钾能力的细菌为主要成分的生物钾肥应用前景广阔。

本试验通过对8株细菌进行解钾能力的测定，发现有两株细菌的解钾能力较好。但是， K2细菌25 ℃条件下对钾长石粉的解钾作用不及20 ℃和30 ℃，这是本试验存在的一个重要问题，可能是由于消煮不彻底，导致很大的误差产生。

同时，本试验证实了8株细菌对白云母的释钾能力均高于钾长石，这可能与矿物结构有关，钾长石是架状结构的硅酸盐矿物，而白云母则是层状结构的硅酸盐矿物，细菌较易于从云母类矿物中获得速效钾。连宾等[16]研究表明，对架状结构的硅酸盐矿物而言，硅酸盐细菌主要通过形成细菌-矿物复合体并由此产生细菌对矿物表面的溶蚀作用，随之矿物颗粒晶格逐渐发生变形或崩解，硅酸盐细菌对矿物钾的主动吸收作用，其代谢产物等化学因子对矿物颗粒有化学降解作用等几种途径来实施对矿物的解钾作用，而对层状结构的含钾矿物而言，硅酸盐细菌还可以通过扩大其层间的距离来促进其中钾离子的释放。这为进一步研究细菌与矿物作用的机理提供了理论依据。

何琳燕等[17]认为生物钾肥功能的有效发挥必须满足两个基本条件：一是菌株的高效性，二是菌株本身对土壤环境的适应性。在将生物钾肥施用在土壤中之前，必须保证该生物钾肥有良好的解钾能力。但是，盛下放等[18]研究发现，胶质类芽孢杆菌中有明显的解钾溶磷作用的只占15%～29%。因此，从我国丰富的胶质类芽孢杆菌资源中筛选出解钾能力较强的胶质类芽孢杆菌具有重要的理论与实用价值。根据试验结果，本研究中所筛选的短短芽孢杆菌和胶质类芽孢杆菌菌株有一定的解钾能力，具备了制作生物钾肥的前提条件，为进一步研究生物钾肥对土壤环境的适应性打下了基础。

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