贵州薏苡黑穗病的发病情况及其病原菌的分离鉴定

刘荣++申刚

摘要 为有效防治薏苡黑穗病，提高薏苡的质量和产量，通过抽样调查薏苡黑穗病的发病情况，并采用组织分离法分离得到薏苡黑穗病病原菌，结合形态学描述、ITS序列比对分析该菌。结果表明：薏苡不同品种（系）之间的感病情况存在差异，同一品种在不同区域的耐病性也不尽相同。此外，结合形态特征和分子生物学方法鉴定得到该病原菌为薏苡黑粉菌。

关键词 薏苡黑穗病；发病情况；病原菌；分离鉴定；贵州地区

中图分类号 S412 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）22-0102-02

Abstract For controlling job′s-tears smut，improving the quality and yield of Coix lacryma-jobi L.，surveyed morbidity of job′s-tears smut，obtained job′s-tears smut by tissue separation，and analyzed the bacteria in combiation with morphological description，ITS sequence alignment.The results showed that occurrence situation of job′s-tears was different among different varieties （or lines） of Coix lacryma-jobi L.，the same varieties in different regions also had different diseased resistance.In addition，we identified the pathogen of job′s-tears was Ustilago coicis Brefeld combined with morphological characteristics with molecular biology methods.

Key words job′s-tears smut；morbidity；pathogenic bacteria；identification；Guizhou Area

薏苡（Coix lacryma-jobi L.），又名藥玉米，属于禾本科（Poaceae）薏苡属（Coix）。薏苡作为一种药食兼用作物，具有丰富的营养价值和药用价值，被誉为“世界禾本科植物之王”[1]。虽然国发[2012]2号文件已将薏苡列为贵州特色发展的主要作物之一，但是贵州地区常年雨量充沛，时空分布不均，3个多雨区之一位于省之西南部，降雨日数较多，相对湿度较大。而水分是影响薏苡黑粉菌厚垣孢子萌发的主要因素之一[2]。薏苡在种植过程中易感染薏苡黑穗病，严重制约着薏苡的产量和品质。薏苡黑穗病是由薏苡黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，病原属于担子菌亚门；该病易感染，分布广，在大多数国家均有报道[3-4]。据1957年、1958年进行的田间调查，发现薏苡黑穗病危害十分严重，大田的平均病株率达80%～100%，病瘿率达50%以上[5]。随着薏苡感病杂交种的推广，连作薏苡的增加，薏苡黑穗病害不断蔓延、加重，以致薏苡产量丧失严重。因此，笔者就贵州地区薏苡同一品种不同生育期以及不同品种间黑穗病进行调查分析，并将薏苡黑穗病病原菌进行分类鉴定，旨在摸清薏苡种植区病情发生情况，为该地区的薏苡黑穗病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 薏苡黑穗病发生情况调查

供试材料为Y83、Y160、Y164，共3个品种（系）；各品种（系）的基本信息如表1所示。

调查时间为2014年5—10月及2015年5—10月；调查地点位于贵州省兴义市、兴仁县、贞丰县、晴隆县，以主栽区兴仁县为主。选择历年薏苡黑穗病发病较重的种植区进行调查。采用对角线5点取样，每点10株，每个品种4个重复，调查薏苡黑穗病发病率和严重度。

1.2 薏苡黑穗病病原菌的分离鉴定

病原菌的分离采用组织分离法及单孢分离法。病原菌的形态鉴定参考《中国真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”描述进行。病原菌的分子鉴定运用通用引物ITSl（5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′）一对引物进行病原菌的ITS（internal transcribed spacer）序列的扩增，连接转化后对阳性转化子进行克隆测序；利用软件DNAStar的MegAlign程序和NCBI上的Blastn程序进行序列比对分析。 仪器与试剂：BX51型显微镜（OL-YMPUS）、XD-1型二氧化碳临界点干燥器（Eiko公司）、IB-3型离子镀金仪（Eiko公司）、JSM-6390LV扫描电镜（JEOL公司）；葡萄糖、琼脂粉、3%戊二醛、乙醇、乙酸异戊脂等。

2 结果与分析

2.1 不同品种（系）薏苡黑穗病发生情况

薏苡黑穗病主要感染薏苡的茎、叶、穗。由表2可知，薏苡在种植过程中感染黑穗病的情况较严重，且不同品种（系）之间的感病情况存在差异。从调查的3个品种（系）来看，Y83的病株率较其他2个品种高，Y160的发病率大于Y164的发病率。以调查地点为依据，不同地区的感病性也不尽相同，3个品种抗黑穗病能力在兴仁县均较弱，Y83和Y160在兴义市的发病率相对要低些，而Y164在晴隆县的耐病性较高。从而可以推断，Y164的抗病能力强于Y160和Y83，而Y83的抗病能力最弱。

2.2 薏苡黑穗病病原菌鉴定

2.2.1 形态鉴定。通过分离得到薏苡黑穗病病原菌后，将其接种到PDA培养基上，28 ℃培养过程中进行菌落形态和显微形态观察。图1为病原菌培养15 d后的菌落形态，可以看出：菌落直径约为5.82 cm，菌落中央皱褶凸起、边缘整齐，表面呈白色、反面淡黄色。显微形态观察：成熟的黑粉孢子近球形或卵圆形，7.45～11.00 μm×7.5～10.5 μm，有刺。通过扫描电镜观察发现：刺间有小疣。以上形态观察描述与《中国真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”的薏苡黑粉菌的形态特征一致，初步断定该病原菌为薏苡黑粉菌。

2.2.2 分子鉴定。根据形态鉴定的结果，选取3个典型菌株，并采用CTAB法提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板，ITSl和 ITS4为引物进行PCR扩增，获得约600 bp的片段（图2），克隆测序后分析显示：3株菌株的扩增序列一致，将其ITS序列在NCBI（national center for biotechnology information）上进行Blastn（核苷酸序列比对）同源性分析发现：该序列与Ustilago coicis（JX219371.1）的ITS 1 5.8S 核糖体RNA基因相似性最高，达99%（图3）。进一步证实薏苡病原菌为薏苡黑粉菌。

3 结论与讨论

通过对Y83、Y160、Y164 3个品种在不同区域耐黑穗病能力进行调查，结果显示Y83抗黑穗病能力最弱，Y160次之；同时调查同一品种在不同区域的耐病性，不同地区的感病性也不尽相同，不同品种（系）在兴仁县的发病率都相对较高。由此可以推断：薏苡不同品种在同一地区感染黑穗病的发生情况存在差异；因贵州地区特殊的气候条件，薏苡同一品种在不同區域耐黑穗病能力不同。而且黔西南属于贵州省三大多雨区之一，降雨日数较多，相对湿度较大，这种温湿度适宜孢子萌发生长。因此，在选择薏苡种植品种时，不仅要重视薏苡的品质、产量，还要考虑品种的抗病能力。

对分离得到的黑穗病病原菌进行形态和分子的综合鉴定，观察得到3个菌株的形态特征和测序结果一致。1940年，Mundkur[6]对植物黑穗病调查研究过程中发现薏苡黑粉菌，并命名为C.lacryma-jobi Mundkur。而Chowdhury[7]提出的观点与Mundkur存在分歧，他在研究过程中把此菌与Ustilago coicis同义进行报道。后来，Zhang等[8]对该菌的超显微形态结构和分子系统发育树进行分析后得出：该菌与Ustilago trichophora亲缘关系最近，达84%。但笔者将研究结果同《中国真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”比较以及对序列比对分析，初步断定该病原菌为薏苡黑粉菌。

4 参考文献

[1] 杨继祥.药用植物栽培学[M].北京：农业出版社，1993：284-292.

[2] 王秀全，傅建国.薏苡黑粉病的防治[J].中药材，1985（3）：3.

[3] SMALL W.Matter of phytopathological interest during 1926[J].Rev Appl Myco，1927（6）：273-274.

[4] TITATARN S，CHIENGKUL A，UNCHALISANGKAS D，et al.Occurren-ce of Ustilago coicis on Coix lachryma-jobi in Thailand[J].Plant Dis，1983，67（4）：434-435.

[5] 李彦勇，郑茂源.薏苡黑穗病[J].植物保护，1964（6）：13.

[6] MUNDKUR B B.A second contribution towards a knowledge of Indian Ustilaginales：Fragments xxvi-l.[J].Trans Br Mycol Soc，1940，24（3/4）：312-336.

[7] CHOWDHURY S.Some studies on the smut Ustilago coicis Bref.of Job′s tears millet[J].J.Indian Bot，Soc，1946（25）：123-130.

[8] ZHANG J Z，GUAN P G，TAO G，et al.Ultrastructure and phylogeny of Ustilago coicis[J].Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2013，14（4）：336-345.