水杨酸钠对小鼠耳蜗单离外毛细胞Prestin分布的影响

张博，王显红，尹时华

(1.湖北科技学院五官医学院，湖北咸宁437100;2.广西医科大学附属第一医院)

水杨酸钠对小鼠耳蜗单离外毛细胞Prestin分布的影响

张博1，王显红1，尹时华2

(1.湖北科技学院五官医学院，湖北咸宁437100;2.广西医科大学附属第一医院)

目的探讨水杨酸钠对小鼠听性脑干反应(ABR)阈值和耳蜗外毛细胞动力蛋白(Prestin)分布的影响。方法将28只成年健康小鼠随机分为4组:生理盐水对照组(A组)、水杨酸钠4d组(B组)、水杨酸钠8d组(C组)、水杨酸钠16d组(D组)。水杨酸钠200mg/kg·d，经腹腔注射，采用美国TDT系统测量听性脑干反应(ABR)阈值，荧光显微镜下观察单离外毛细胞Prestin的分布。结果①听功能检测显示:与A组比较，B组小鼠ABR阈值升高，但变化尚不显著(P＞0.05);C组和D组小鼠ABR阈值明显提高，与A组比较有显著性差异(P＜0.05);D组小鼠ABR阈值与C组比较有所降低，但无显著性差异(P＞0.05)。②荧光显微镜下显示:A组单离外毛细胞侧膜和底部膜可见明显的Prestin抗体阳性染色，B、C、D组Prestin在外毛细胞膜上分布不均匀，主要分布在外毛细胞侧膜。B组底部细胞膜可见少量阳性染色，C、D组底部细胞膜少量或无Prestin的阳性染色。结论水杨酸钠致小鼠听力下降可能与其导致的外毛细胞底部膜Prestin表达异常有关。

水杨酸钠;耳蜗;外毛细胞;外毛细胞动力蛋白;小鼠

耳蜗具有频率选择和放大效应，这一生理特征被认为与耳蜗外毛细胞(outer hair cells，OHC)的电能动性有关。大量的资料证实［1，2］，OHC的电能动性与其侧壁上外毛细胞动力蛋白(Prestin)有紧密联系。Prestin又称为动力蛋白(motor protein)，是电运动和耳蜗放大效应的分子基础。水杨酸钠是临床常用的解热、镇痛、抗风湿药物，长时间或高剂量应用容易产生毒副作用，主要表现为可逆的双耳对称性高调耳鸣和听力下降［3］。关于水杨酸钠毒副作用机制研究很多，但确切机制尚不完全清楚。耳蜗电生理学和形态学研究发现，OHC是水杨酸钠耳毒性作用的靶细胞，OHC功能的改变在水杨酸钠耳毒性机理研究中起重要作用［4，5］。近年来随着OHC膜Prestin的发现，水杨酸钠耳毒性作用与Prestin之间的关系也成为研究热点。本实验以小鼠为研究对象，观察水杨酸钠对听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)阈值和外毛细胞动力蛋白分布的影响，以此探讨水杨酸钠的耳毒性机制，从而为指导临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与给药28只经检测听阈正常的成年健康小鼠(广西医科大学动物实验中心提供)，雌雄不限，体重分布在18～25 g。随机分为4组，每组7只。生理盐水对照组(A组)、水杨酸钠4d组(B组)、水杨酸钠8d组(C组)、水杨酸钠16d组(D组)。B、C、D组均经腹腔注射水杨酸钠200mg/kg·d，分别在4、8、16d进行ABR检测，A组给等量生理盐水，水杨酸钠注射液购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 听性脑干反应(ABR)阈值检测各组小鼠用美国TDT系统进行双侧ABR测试。小鼠经1%戊巴比妥钠(上海西唐科技公司)按35～40 mg/ kg腹腔注射麻醉，实验在隔声屏蔽室内进行。微型记录电极放置于两耳廓前沿连线中点，参考电极置于同侧耳垂，地线接鼻尖。实验采用短声(Click)，带通滤波为300～3000 Hz，叠加次数为1024次，扫描时间10ms。起始给声95 dB SPL，以5 dB SPL或者10 dB SPL依次递减，以能引出明确的、可重复的观察波形的最小刺激强度为听反应阈。

1.3 外毛细胞分离培养及免疫荧光染色ABR阈值检测后，各组动物迅速断头并取出颞骨，打开听泡置于PBS溶液中，在解剖显微镜下剥去蜗壳，用游丝镊剔除螺旋韧带和螺旋神经节组织后分离出含Corti器的基底膜，移除Reissner氏膜和Tectorial膜，置于浓度为0.25 mg/ml的木瓜蛋白酶中，37℃孵育10～12min，轻柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液终止消化。悬液经离心后去上清液，加入1 ml培养液在37℃，5%CO2孵箱孵育24h。经24h培养后的外毛细胞用4%多聚甲醛固定30min，PBS浸洗5min，3次。封闭液(10%山羊血清和1%BSA)封闭30min，PBS浸洗5min，3次。1∶1 000羊抗Prestin多克隆抗体(Prestin Antibody(C－16):Sc－22694，Santa Cruz) 4℃过夜，室温复温10min，PBS浸洗5min，3次。1∶64的FITC标记的兔抗羊IgG二抗抗体(BA1l10，武汉博士德)在室温下孵育1h，PBS浸洗5 min，3次。封片后荧光显微镜下观察，阳性染色为绿色荧光。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0统计学分析软件，实验数据以(¯x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR阈值变化与正常对照组比较，连续用药4d，小鼠ABR阈值水平提高，但变化尚不显著(P＞0.05);8d和16d组小鼠ABR阈值明显提高，与对照组或4d组比较存在统计学差异(P＜0.05);16d组小鼠ABR阈值与8d组比较有所降低，但无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组小鼠ABR阈值比较(dBSPL，¯x±s，n=7)

2.2 耳蜗单离外毛细胞膜Prestin分布荧光显微镜观察荧光显微镜下显示，A组单离0HC侧膜和底部膜可见明显的Prestin抗体阳性染色，Prestin表达较均一完整。B、C、D组Prestin分布不均匀，主要分布在OHC侧膜。B组底部细胞膜可见少量阳性染色，C、D组底部细胞膜少量或无Prestin蛋白的阳性染色。

3 讨论

人们已经知道，能够对声波引起的耳蜗基底膜振动进行放大和修饰的外毛细胞电运动，是哺乳动物内耳听觉器官高灵敏度和频率选择性的基础。当声音刺激传入耳蜗引起基底膜振动时使外毛细胞顶部纤毛发生偏移，从而开放纤毛顶端的机械换能通道，产生换能电流。外毛细胞还可由于其膜电位和膜电流的变化导致自身产生收缩与舒张运动，外毛细胞具有的这种电－机械换能特性被称为电能动性，其可对基底膜的运动进行反馈性调制，实现耳蜗放大作用。

大量的资料证实，OHC的电能动性与其侧壁上Prestin有紧密联系。Prestin又称为动力蛋白，是外毛细胞电－机械活动和耳蜗放大作用所必需的蛋白，并特异性地在耳蜗外毛细胞膜上表达［6，7］。近年来有人对单离外毛细胞Prestin抗体免疫荧光染色发现:Prestin不仅分布在外毛细胞侧膜上，而且在基底部侧膜与细胞底端细胞膜也存在［8］。Liberman等通过对Prestin基因缺失小鼠的研究发现，小鼠听阈上升且OHC能动性丧失，说明Prestin基因及其蛋白在外毛细胞电能动性中发挥着重要作用［9］。

Prestin作为动力蛋白具有两个基本功能:①电压感受器功能，可感受外毛细胞的跨膜电压改变;②驱动器功能(即电－机械力的转换器功能)，Prestin通过本身构型变化促使外毛细胞伸长和缩短，其可单独完成电－机械转换过程，不需要额外的能量消耗或细胞骨架结构的参与。细胞膜电压的变化，可诱发其构象变化，从而引起外毛细胞长度改变。外毛细胞质膜去极化引起胞体缩短，超极化引起胞体伸长［1，10］。

由于Prestin属于阴离子转运家族SLC26的成员，因此也显示出与阴离子转运器相似的一些特征。有人推测Prestin是一个被修饰的阴离子转运器，细胞内阴离子(Cl－或HCO3－)对外毛细胞电运动和Prestin的功能具有重要意义。单价阴离子尤其是Cl－被证实为其最有效的刺激因素。Cl－与Prestin结合位点结合，导致Prestin构象的改变，引起OHC体壁的伸缩变化，从而产生电能动性。在去除细胞质内的Cl－后，可使转染Prestin细胞的电动性和非线性电容(门电流)均消失［11，12］。

水杨酸钠是一种临床上广泛使用的药物，长期应用会引起听力下降及耳鸣等临床症状。目前关于水杨酸钠毒副作用机制研究很多，其确切机制尚不完全清楚。电化学研究表明［13，14］，水杨酸钠是Prestin阴离子结合位点的竞争性拮抗剂，其与Prestin上阴离子结合位点的亲和力是Cl－的300倍，但结合后所产生的电－机械运动远小于Cl－。因此注射大剂量水杨酸钠使OHC电能动性减小，是导致听力损失的可能原因之一。我们实验中也观察到:连续用药4d后，小鼠即出现ABR阈值升高，听力下降，尤其C组表现得最为明显，结果说明水杨酸钠对听力有损伤作用，另外D组ABR阈值低于C组似乎表明小剂量水杨酸钠所导致听力下降具有自我恢复的特点。荧光显微镜下显示:A组OHC膜可见Prestin抗体阳性染色，其中包括细胞侧膜与底端膜，Prestin分布较均一完整;B、C、D组Prestin在外毛细胞膜上分布不均匀，尤其C、D组OHC底端膜少或无Prestin蛋白的阳性染色。结果提示:水杨酸钠致小鼠听力损害与外毛细胞底部膜Prestin表达异常存在密切关联。其产生可能原因:①水杨酸钠是Prestin阴离子结合位点的竞争性拮抗剂，能使Cl－与Prestin结合位点的亲和力下降，导致OHC电能动性减小。②本实验注射水杨酸钠后，外毛细胞膜Prestin分布发生变化，尤其底部膜Prestin分布减少或消失。由于外毛细胞底端为突触所在部位，底部的突触实际上也具有传入神经的成分，有人推测可能有其传入性的信号需要经过外毛细胞及其突触结构的处理，其中Prestin可能参与了这些传入性的信号处理过程，Prestin在神经递质囊泡释放过程中起重要作用［8，15］，外毛细胞底部膜Prestin分布减少可能影响此作用。组织学研究也表明，水杨酸钠可以导致毛细胞底侧膜系统的膜下池明显肿胀、空泡形成［4］。总之OHC底部膜Prestin分布变化，可能是水杨酸钠导致听力下降的原因之一，其详细机制还有待进一步研究。

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The Effects of Sodium Salicylate on the Prestin Distribution in Single Outer Hair Cells of Cochlea Mice

ZHANG Bo，WANG Xian－hong，YIN Shi－hua
(Department of Otorhinolaryngology，Hubei University of Science and Technology，Xianning Hubei 437100，China)

ObjectiveTo investigate the effects of sodium salicylate on the auditory brainstem response (ABR)thresholds and dynein(Prestin)distribution in outer hair cells of cochlea mice.Methods28 healthy adult mice were randomly divided into four groups.Group A:the saline control group;Group B:the sodium salicylate 4 days group;Group C:the sodium salicylate 8 days group;Group D:the sodium salicylate 16 days group.Sodium salicylate was injected by intraperitoneal injection(200mg/kg·d).Auditory brainstem response thresholds were detected by the United States TDT system.The distribution of prestin was examined by fluorescence microscopy.Results①Auditory function tests showed:the ABR thresholds of group B increased，but the change is not significant when compared with group A(P＞0.05);ABR thresholds of Group C and D were significantly levated，there was a significant difference(P＜0.05)when compared with group A;there was no significant difference between group C and group D(P＞0.05).②fluorescence microscope showed:Group A，the membrane side and bottom of single outer hair cell can be seen clearly prestin antibody staining.B、C、D group，prestin uneven distributed in the outer hair cell membrane，mainly distributed in the side membrane of outer hair cells.Group B，the bottom membrane showed small amount staining.C、D group，the membrane bottom of outer hair cell showed little or no prestin positive staining.ConclusionSodium salicylate induced mice hearing loss may be correlated with prestin abnormal expression in bottom membrane of outer hair cells.

Sodium salicylate;Cochlea;Outer hair cells;Prestin;Mice

R965

A

2095－4646(2015)01－0006－04

2014－10－11)