鸟纲类生物鸡用于耳蜗毛细胞再生领域研究进展

万良财

南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉科(广州 510282)

上世纪80年代，Cruz等为研究氨基糖苷类抗生素的耳毒性，以鸡耳蜗为研究对象，研究发现鸡耳蜗毛细胞在损伤后，具有较强自发再生能力，并因此开创了内耳毛细胞再生的新纪元[1]。此后，耳蜗毛细胞再生研究一直是耳科学界的热点。鸡作为鸟纲类动物的代表，因具有易于繁殖、胚胎期短、耳蜗取材方便及毛细胞再生能力较强等优点，一直是研究内耳毛细胞再生的理想动物之一。本文对鸡耳蜗模型用于内耳毛细胞再生领域的研究现状及进展综述如下。

1 鸡耳蜗解剖

鸡耳蜗与哺乳动物耳蜗的外形大不相同，但功能相似，它是一条短而弯曲呈香蕉状的管，由三部分组成：听壶，属前庭器官，与位觉斑相似；血管盖，构成蜗管上壁及部分侧壁，其间富含血管；听觉感受器又称基底乳头(basilar papilla,BP)，呈镰刀状，位于上、下软骨板之间，由基底膜、毛细胞、支持细胞构成。BP由近端向远端逐渐增宽，近端尖锐，远端圆钝，凸侧为神经缘，凹侧称非神经缘。其表面的毛细胞呈马赛克图案样排列，毛细胞分为两种类型，即高毛细胞与矮毛细胞。靠近神经部的毛细胞称为高毛细胞，呈柱状。靠近非神经部的毛细胞称为矮毛细胞。高毛细胞类似于哺乳动物耳蜗的内毛细胞，而矮毛细胞则类似于哺乳动物耳蜗的外毛细胞，支持细胞有助于保持基底乳头结构的完整性，维持网状层离子屏障，以及新毛细胞的产生[2]。

2 鸡耳蜗毛细胞损伤与再生研究

2.1 鸡耳蜗毛细胞损伤模型的建立

2.1.1 噪声性聋模型

Cotanche等最早利用10日大的雏鸡暴露于声压级120 dB SPL的1500 Hz纯音环境48小时构建噪声性聋模型，在暴露后0 h，24 h，48 h，4 d，6 d和10d对其耳蜗进行透射和光学显微镜处理。研究发现毛细胞损伤呈现出两种类型，第一种损伤毛细胞完全丧失，第二种毛细胞存活但表现出不同程度的静纤毛损伤。噪声暴露48小时后，在毛细胞丧失区域即出现新的毛细胞。暴露后10天，损伤毛细胞基本恢复[3]。此后，根据不同试验需求，Co⁃tanche又将噪声性聋毛细胞损伤分为中等程度与严重程度。以1500 Hz，120 dB SPL噪声暴露24小时或以900 Hz，120 dB SPL噪声暴露48小时可引起毛细胞中等程度损伤，即毛细胞损伤而不造成支持细胞损伤；而以1500 Hz，123 dB SPL噪声暴露24小时或900 Hz 124 dB SPL噪声暴露24小时不仅造成毛细胞严重损伤，同时也可造成支持细胞严重受损，即严重噪声性损伤[4]。Kurian等利用噪声暴露模型来研究毛细胞噪声刺激后静纤毛尖端连接改变，实验时雏鸡予0.9 kHz，120 dB SPL纯音噪声分别暴露4小时，24小时或48小时。研究发现矮毛细胞上静纤毛尖端连接损失分别为30.3、40.6和35.5%。暴露48小时的雏鸡予恢复24、96或288小时后，尖端连接可恢复至对照水平。高毛细胞尖端连接丧失与恢复与矮毛细胞类似[5]。Sliwinska-Kowalska等予120 dB SPL，每天暴露8小时，连续五天，或120 dB SPL连续暴露72小时成功构建了鸡耳蜗毛细胞损害模型。研究发现，高强度噪音暴露可造成基底乳头中部及近端毛细胞损坏，在基底乳头中部毛细胞胞浆，支持细胞胞核和神经节细胞胞浆中均免疫表达生长因子bFGF及NGF[6]。

2.1.2 氨基糖甙类耳毒性模型

虽然氨基糖甙类药物耳毒性机制目前尚不清楚，但予其制作耳毒性模型已广泛应用于听力学实验研究。Xiang等为了探讨新生毛细胞有抗硫酸卡那霉素耳毒性作用，对3日大小雏鸡每天肌注硫酸卡那霉素（200 mg/kg），连续10-30日构建体外耳蜗毛细胞损伤模型，予扫描电子显微镜检查基底乳头。研究发现，基底乳头新再生的不成熟的毛细胞具有一定的抗耳毒性能力，但随着毛细胞的发育成熟则逐渐丧失了这种能力[7]。Shang等为了研究在耳蜗毛细胞损伤后，支持细胞是如何转化为新生毛细胞的，体内试验通过对5～10日大小的雏鸡连续两日皮下注射庆大霉素（250 mg/kg）；而体外试验，以含78 μM链霉素DMEM或BME/EBSS培养基培养基底乳头1～12日构建毛细胞损伤模型。研究表明，体内体外试验，支持细胞有丝分裂和毛细胞分化的时间进程是类似的，支持细胞直接分化成毛细胞是毛细胞再生的一重要机制[8]。为了探讨BMP4在内耳毛细胞再生中的作用，Lewis对7～10日大小的雏鸡基底乳头予含链霉素（172μM）DMEM体外培养，成功构建毛细胞损伤模型。研究发现，在毛细胞受损基底乳头，BMP4可以抑制毛细胞再生，其原因可能是由于BMP4可以阻止ATOH1在支持细胞的聚集[9]。Jiang为研究毛细胞再生所涉及的候选基因和信号通路提供一个相对完整的数据库，通过对6至8天大小的雏鸡连续皮下注射庆大霉素(0.25 mg/g)两天，造耳蜗毛细胞受损模型，通过RNA-Seq数据分析发现，在实验组与对照组耳蜗，共发现有16588个基因表达，在注射后第3日，发现有805个差异表达基因[10]。最近，Wan等为了研究VEGF在耳蜗毛细胞再生中的作用，依据实验不同，予含链霉素（172μM或1mM）两种浓度DMEM培养4～11日大小的雏鸡基底乳头1～2天成功构建毛细胞丧失体外模型，研究表明，这两种浓度在1～2日均几乎可破坏全部毛细胞。支持细胞有丝分裂大多发生在开始给药后的2～4日，少量新生毛细胞在开始给药后的3～4日，至给药后第8日，约有1/3再生毛细胞出现，此后，随着时间延长，再生毛细胞数量可恢复至正常水平[11]。

2.1.3 铂类药物耳毒性模型研究

众所周知，铂类药物具有耳毒性，予铂类药物制作耳毒性模型已用于鼠类及斑马鱼内耳毛细胞再生研究[12-14]。能否用顺铂来构建鸡耳蜗毛细胞再生研究模型呢？Eric等予含10-20 μM顺铂培养基来孵育基底乳头24小时，予3 μg/ml BrdU来监测支持细胞有丝分裂，发现基底乳头毛细胞损害最早发生在远端低频区，从近端高频区至远端低频区呈现一渐近加重独特的调亡坏死模式。研究认为，支持细胞因治疗后发生裂解调亡，不能通过增生或直接分化的方式而再生出新的毛细胞[15]。

2.2 鸡耳蜗再生毛细胞的来源

Cotanche早期研究发现，在基底乳头毛细胞受损后，支持细胞和排列在听觉上皮非神经缘的透明细胞可以吸收外源核苷酸并进入S期，因此，认为这两种细胞有可能是再生毛细胞的前体细胞。但随后又排除了透明细胞作为再生毛细胞前体细胞的可能，因为透明细胞增殖和迁移到毛细胞受损区域后并不会形成新的毛细胞[4]。此后越来越多的研究者认为，在鸡等鸟纲类动物，正常组织更新或毛细胞损害后产生新毛细胞的祖细胞是支持细胞[16]。Roberson在毛细胞再生的整个过程中加入3H-胸苷或溴脱氧尿苷，大量新再生的毛细胞并未标记3H-胸苷或溴脱氧尿苷，这说明这些未标记3H-胸苷或溴脱氧尿苷新再生的毛细胞并不是通过有丝分裂的方式转化而来的[17]。此后，Stone课题组研究亦发现，正常情况下，基底乳头不会出现增殖，但在毛细胞损害或消失后，支持细胞会再次进入S-阶段和分裂。鸡基底乳头毛细胞再生是干细胞所驱动的过程，毛细胞可以通过支持细胞分裂增殖产生，也可通过支持细胞表型转换（亦称为“直接分化”或“非有丝分裂”）而产生。虽然有丝分裂和直接分化可以同时发生，但基底乳头非神经部区域优先以直接分化再生新的毛细胞，在此区域约三分之一新再生的毛细胞表达溴脱氧尿苷（BrdU），亦即认为仅三分之一新再生的毛细胞是通过支持细胞有丝分裂而来的。支持细胞直接分化成毛细胞是毛细胞再生的一重要机制[8,18]。

2.3 鸡耳蜗再生毛细胞的生理功能

为了研究再生毛细胞听功能恢复情况，不同研究者对新生毛细胞畸变产物耳声发射(DPOAE)、听性脑干反应(ABR)及瞬态钙离子电流等进行研究。Trautwein将雏鸡暴露于525Hz纯音，120dB SPL，48小时，比较暴露前后的DPOAE。研究表明，噪声暴露不仅导致大量毛细胞丧失，还导致了基底乳头神经部从低频至中频区域盖膜破坏，虽然病变范围局限，但DPOAEs所有频率幅值在暴露后立即明显降低。此后，高频DPOAE可逐渐恢复到暴露前水平[19]。李胜利等对出生后16～20日雏鸡按50mg/(Kg/d)肌注庆大霉素共10日后，间隔1、3、6、9和12日对鸡耳蜗电位及听觉脑干诱发电位进行测定。研究发现，在毛细胞损伤初期，耳蜗电位及听觉脑干诱发电位明显升高达80 SPL dB，但在庆大霉素注射9～12日，再生毛细胞已基本发育成熟，耳蜗电位及听觉脑干诱发电位亦基本正常,说明毛细胞再生在听功能恢复中起重要作用[20]。Ipakchi通过对雏鸡及成年鸡对比研究发现，在强噪声暴露后，它们的耳蜗结构和功能都受到严重损害。对于雏鸡，噪声暴露虽会造成内耳损伤，在暴露后12天DPOAE完全恢复，暴露后2-4周，能恢复稳态的蜗内电位；但在成年鸡，噪声暴露对蜗内电位几乎没有影响，DPOAE在暴露后12天几乎没有恢复。研究认为，对于雏鸡，12天足以充分修复内耳损伤，彻底恢复正常的DPOAE[21]。Levic等认为再生的毛细胞如要有正常毛细胞的生理功能，就必须要有正常的突触和适度的离子电流表达。为了明确再生的毛细胞如何在成熟耳蜗中确立其功能生态位，Levic予庆大霉素治疗后鸡动物模型，诱导基底乳头底部约1/3毛细胞损害。研究发现与成熟的毛细胞相比，新再生细胞可表现出与正常成熟毛细胞类似的瞬态钙离子电流，这种电流在庆大霉素治疗后7天再生的毛细胞最为明显，且这种瞬态钙离子电流可以诱导自发动作电位的产生[22]。

2.4 鸡耳蜗毛细胞再生相关的基因及信号通路

通过研究终生具有再生功能的鸡听觉毛细胞的再生机制，有助于为哺乳动物寻找有效的干预靶点，解除阻断毛细胞再生的机制，为最终解决哺乳动物内耳毛细胞再生提供重要的借鉴意义。迄今为止，启动鸡内耳毛细胞再生的精确信号机制尚不清楚，研究者普遍认为内耳毛细胞再生是一极其复杂的过程，涉及众多的基因和信号通路，其中，Atoh1是被研究最多的转录因子，而Notch、EGFR、FGF、Wnt/b-catenin等信号通路一直是研究的热点。

Cafaro等研究发现在基底乳头毛细胞损害后，碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子Atoh1被激活，进而进一步激活支持细胞通过分化或有丝分裂再生出新的毛细胞[18]。Lewis等研究发现，在基底乳头毛细胞受损后，支持细胞Atoh1表达明显上调[23]。BMP4可拮抗鸡基底乳头的毛细胞再生，其可能原因是通过阻止Atoh1在毛细胞前体细胞中的聚集[9]。Mulvaney等通过对鸡Atoh1(cAtoh1)及鼠Atoh1(hAtoh1)进行比较，发现在克服Sox2抑制毛细胞分化方面，cAtoh1比hAtoh1更有效，cAtoh1能有效促进鸡感觉毛细胞的分化[24]。Jiang研究发现，在基底乳头毛细胞损害区域，支持细胞Atoh1表达上调；在毛细胞再生早期，支持细胞Sox2表达上调，但当支持细胞转化为成熟的毛细胞后，这种上调便停止[25]。Daudet认为在正常鸡基底乳头，Notch信号通路相关基因如Notch1，Notch2与Ser⁃rate1 呈高表达，而Serrate2，Delta1，Atoh1，Hes5，Hes6，MINT和呈相对低表达，但当毛细胞丧失后，支持细胞Hes5与Delta1呈高表达。抑制γ分泌酶能促进Atoh1与Delta1的表达，降低Hes5的表达，这种改变并没有明显直接促进支持细胞进入细胞周期进行有丝分裂，但可促进支持细胞直接分化成新的毛细胞[26]。

White予经链霉素治疗后的基底乳头为研究对象，予AG1478抑制EGFR信号通路后，支持细胞有丝分裂明显减少，且这种减少并不是因为支持细胞死亡而导致的。研究表明EGFR信号通路对促进支持细胞再次进入细胞周期十分重要，并有可能是通过下调p27Kip1而实现的[27]。Jacques以E5-E12大小基底乳头为研究对象，研究发现，在发育中的基底乳头，Wnt/β-catenin信号被激活，基底乳头所有上皮细胞均表达β-catenin。予IWR-1抑制Wnt信号通路能明显抑制细胞增殖，相反，以LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路则能显著增加毛细胞的数量，研究表明，Wnt/β-catenin信号在内耳毛细胞再生中起重要的作用[28]。杨思远等以7日大小雏鸡为研究对象，以链霉素对体外培养的基底乳突造成毛细胞损伤。研究发现，同时抑制Notch信号通路，激动Wnt信号通路，可使毛细胞的再生效果达到最佳状态[29]。

近年来，为了从生物信息学角度来阐明内耳毛细胞再生机制，研究者应用RNA-Seq，cDNA微阵列等不同方法，调查鸡内耳毛细胞受损后转录谱的改变[10,30]。Jiang通过对基底乳头毛细胞再生过程中的基因表达进行高通量基因表达转录组分析，研究发现鸡耳蜗表达16,588个基因，其中在不同组别中有1000个差异表达基因，这些基因涉及包括在胚胎发育过程中起重要作用的如Notch,MAPK(FGF),Wnt和TGF-b(BMP)等约100条信号通路，这为研究毛细胞再生所涉及的候选基因和信号通路提供一个相对完整的数据库[10]。最近，Wan等利用RNA-Seq方法，发现鸡基底乳头经链霉素治疗后，VEGF信号通路相关基因VEGFA,VEGFC,VEG⁃FR1，VEGFR2，VEGFR3表达上调，研究表明，在毛细胞受损后VEGF可以正向促进毛细胞再生，但其具体机制尚不明确[11]。

3 鸡耳蜗在感音神经性聋的其它应用研究

HUANJU等对胚胎鸡基底乳头予链霉素治疗后发现，E12和E14胚胎鸡基底乳头毛细胞几乎不受影响，E16和E18胚胎鸡基底乳头，毛细胞有中等程度的损害，神经部的毛细胞对链霉素敏感，更易受到破坏。研究表明，与孵化后鸡基底乳头毛细胞不同，胚胎鸡基底乳头毛细胞对氨基糖苷类并不敏感，不易受到损害[31]。Tompkins以鸡耳蜗毛细胞为研究对象，对尖端链接进行了深入地研究，研究发现尖端链接是毛细胞机械电转导过程中必需的分子丝，尖端链接形成和静纤毛长度控制是相耦合的。通过观察各个尖端链接分子，并观察它们如何相互作用、动态移动及观察纤毛长度，深入地解释了尖端链接的形成和异常链接修剪是如何发生的[32]。

4 小结

鸡耳蜗因取材方便且毛细胞再生能力较强等优点，近40年来一直是研究内耳毛细胞再生的理想动物之一。目前，鸡耳蜗毛细胞损伤实验造模方法已十分成熟，通常包括噪声暴露造模、氨基糖甙类造模。广大研究者以鸡耳蜗毛细胞损伤模型，对再生毛细胞的前体细胞，再生毛细胞的生理功能及内耳毛细胞再生的信号机制进行了深入地研究。自2011年以来，以美国听力健康基金会（HHF）牵头成立了第一个以研究内耳毛细胞再生的国际研究协会HRP(Hearing Restoration Project)，研究者分别以鸡、鼠、斑马鱼三类不同动物为研究对象进行内耳毛细胞再生研究，比较不同物种内耳毛细胞再生机制异同，他们分工协作，数据共享，取得了一系列的研究成果，并将内耳毛细胞再生研究推向了一新的高度[11,33,34]。这也为鸡作为研究耳聋的动物模型奠定了坚实的基础，为丰富内耳毛细胞再生的内容，阐明耳蜗毛细胞再生的分子机制及今后治疗因耳蜗毛细胞损伤造成的感音神经性耳聋提供重要的理论基础。