HPLC 法测定水杨酸钠注射液中水杨酸钠的含量

陈向丹，王 峻，龚 波，董书香

（湖北省兽药监察所，湖北武汉430070）

水杨酸钠（sodium salicylate）又名邻羟基苯甲酸钠，为白色或微显淡红色的细微鳞片，或白色粉末及球状颗粒，用于风湿症等。水杨酸钠注射液由水杨酸钠加适宜的抗氧剂和金属络合物制成的灭菌水溶液。静脉注射用于马、牛、羊、猪、犬的风湿症，是1种解热镇痛药。目前，查阅到水杨酸钠相关分析研究内容均不涉及高效液相色谱法[1-6]，仅查阅到水杨酸钠注射液的国内标准。其含量测定采用双相滴定法。该法操作烦琐，且乙醚存在刺激性大、沸点低、易燃等不安全性。为了避免使用乙醚对人体产生的刺激麻醉作用及其危险性，同时提高专属性，本试验拟采用高效液相色谱法对水杨酸钠含量进行测定，为水杨酸钠含量的测定提供可行的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪-紫外检测器（Agilent1260 Infinity Ⅱ，OpenLAB CDS ChemiStation Edition（C.01.09[144]）色谱工作站软件）、分析天平（梅特勒AE 240）、乙腈为色谱纯、冰乙酸为优级纯、水（超纯水）。

1.2 药品

水杨酸钠对照品（含量：99.0%，批号：Z05A6Y2161，北京盛世康普化工技术研究院）；空白制剂：四川某已获兽药GMP认证企业提供；供试品：水杨酸钠注射液（四川3个已获兽药GMP认证企业生产，含量规格均为10%，批号分别为：170401、20170101、20170901）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

最终色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，以水-乙腈-冰乙酸（197∶100∶3）为流动相、流速1.0 mL/min、检测波长230 nm、柱温30 ℃、进样量10µL。

1.3.2 溶液的制备

对照品溶液：精密称取水杨酸钠对照品25 mg，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：精密量取水杨酸钠注射液5 mL，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述供试品溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2 结果与分析

2.1 线性与范围（见图1）

精密称取水杨酸钠对照品100 mg，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液（约1 g/L）。分别精密量取贮备液适量，用流动相分别稀释至浓度为25、50、100、250、500 mg/L 的溶液，各取10 μL 进样，记录色谱峰面积，以浓度（mg/L）为横坐标，峰面积（mAU·s）为纵坐标，绘制标准曲线。由图1 可知，回归方程：y=22.481x+134.9，R=0.999 7。可见，在此色谱条件下水杨酸钠在25~500 mg/L范围内线性良好。

图1 水杨酸钠标准曲线图Fig.1 Standard curve of sodium salicylate

2.2 准确度（见表1）

精密量取水杨酸钠注射液制剂空白5 mL，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述供试品空白溶液5 mL，置100 mL 量瓶中。水杨酸钠对照品按照各主成分80%、100%、120%3 个水平各3 份分别进行添加制备供试样，按外标法以峰面积计算。由表1可知，水杨酸钠平均回收率为99.76%，RSD为0.3%，表明该法符合试验分析要求、准确度高。

表1 回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.3 精密度

精密吸取对照品溶液（水杨酸钠250 mg/L）10µL，连续重复进样6 次，测得水杨酸钠峰面积平均值为5 953.1，RSD为0.1%，结果表明仪器精密度良好。

2.4 专属性（见图2）

在色谱条件下，分别取样品空白制剂溶液、水杨酸钠对照品溶液以及供试品溶液注入液相色谱仪。

由图2 可知，色谱图中水杨酸钠峰与各杂质峰分离效果好，含量测定不受其他杂质峰的干扰。

2.5 溶液的稳定性

取同一样品溶液（批号20170901）（含水杨酸钠250 mg/L），按色谱条件，在不同时间（0、2、4、6、8、10、12、24 h）分别进样10µL，记录色谱峰面积，考察样品的稳定性，测得水杨酸钠峰面积平均值为5 952.9，RSD 为0.1%，结果表明，样品溶液在室温下24 h内性质稳定。

2.6 耐用性

在本研究的色谱条件下，分别考察了Waters SymmetryShieldRP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）以及Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 种色谱柱。结果表明，3 种色谱柱均可使水杨酸钠分离度及理论塔板数良好，在本研究流动相下选择温度为25 ℃和35 ℃时，除出峰时间发生变化外，其余变化很小；将流动相流速调整为0.9 mL/min 和1.1 mL/min 进行测试。结果表明，流动相流速的微调也仅能影响出峰时间，对峰形和理论塔板数影响甚小。综上所述，不同品牌的色谱柱、不同流动相流速以及不同温度，均能满足试验需要，方法耐用性较好。

2.7 样品测定（见表2）

分别取不同厂家不同批号的样品，采用色谱条件进行测定，按外标法以峰面积计算水杨酸钠的含量，同时按原含量测定方法测定含量。由表2可知，原方法与修订后的方法结果基本一致，高效液相色谱法可作为水杨酸钠注射液中主药的含量测定的参考方法。

图2 高效液相色谱图Fig.2 The high performance liquid chromatogram

表2 样品含量测定结果Tab.2 Results of contents determination of samples(labelled amount/%,n=3)

3 讨论

3.1 提取方法的考察

水杨酸钠在水中易溶，在乙醇中溶解。分别采用水和流动相溶解稀释，均可较好溶解，但水溶解后相同条件采集的色谱图中溶剂产生的色谱峰较大，故选择流动相溶解。

3.2 流动相的选择

查阅相关文献，先后考察多种流动相[7-12]。反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时宜选用已经乙腈-水系统，减少盐溶液对色谱系统的污染，提高色谱系统的稳定性，最终选用氟苯尼考及其制剂的含量测定方法的流动相。选择此色谱条件实现1种方法两种应用，能够节约成本、提高效率，从某种程度上还能控制非法添加物。

3.3 检测波长的选择

水杨酸钠的光谱图最大吸收波长为230 nm 和296 nm。在本试验色谱条件下，在296 nm处水杨酸钠、氟苯尼考及甲砜霉素的混合对照品中的氟苯尼考及甲砜霉素基本不出峰，而在此色谱条件下230 nm处水杨酸钠、氟苯尼考及甲砜霉素3个成分均能分离良好，根据吸收大，干扰小的原则最终选择230 nm。

4 结论

高效液相色谱法具有经济、快捷、所用试剂毒性小、环境友好等优点。该法操作简单、专属性强、准确度及重现性均较好，可作为水杨酸钠注射液的含量测定的1种补充方法，可为水杨酸钠注射液含量的测定提供参考。