上调miRNA145对肝癌细胞的作用及其机制研究*

王寰昱，王亚峰，张昆松，张朝晖，张梓健，黄陕州，吴　健，彭宝岗，陈　东△，周　奇△(中山大学附属第一医院肝胆外科，广东广州50080;河南省人民医院肝胆外科，河南郑州450000)



上调miRNA145对肝癌细胞的作用及其机制研究*

王寰昱1▲，王亚峰2▲，张昆松1，张朝晖1，张梓健1，
黄陕州1，吴健1，彭宝岗1，陈东1△，周奇1△
(1中山大学附属第一医院肝胆外科，广东广州510080;2河南省人民医院肝胆外科，河南郑州450000)

［摘要］目的:探讨微小RNA145 (miRNA145)对肝癌细胞生长、凋亡及侵袭转移的影响。方法:实验将HepG2细胞随机设置为3组:空白对照组、空质粒组及转染组，转染后real-time PCR法检测验证各组细胞miRNA145及N-钙黏蛋白(N-cadherin) mRNA的表达，并用Western blot检测miRNA145目标蛋白N-钙黏蛋白的表达，MTS增殖实验检测各组细胞的生长情况，流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率，Transwell法检测各组细胞的侵袭转移能力。结果: Real-time PCR结果证实转染组细胞miRNA145表达比空质粒组和空白对照组细胞明显增多(P＜0.05)，同时N-钙黏蛋白的表达在转染组细胞中显著减少(P＜0.05) ;经Western blot结果证实，转染组细胞中N-钙黏蛋白表达比空质粒组和空白对照组细胞明显减少(P＜0.05) ;转染组细胞活性在转染后第2天、第3天均明显下降，70.04%的细胞周期停止在G1期，转染后HepG2细胞凋亡率明显增高，细胞的侵袭转移能力下降，差异均有统计学意义。结论:上调miRNA145表达能有效抑制肝癌细胞的细胞周期进展和侵袭转移，促进细胞凋亡。

［关键词］微小RNA145;肝细胞癌;细胞增殖;细胞凋亡;细胞侵袭

［修回日期］2015-05-04

▲并列第1作者

Role of up-regulated microRNA145 in viability，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma cells

WANG Huan-yu1，WANG Ya-feng2，ZHANG Kun-song1，ZHANG Chao-hui1，ZHANG Zijian1，HUANG Shan-zhou1，WU Jian1，PENG Bao-gang1，CHEN Dong1，ZHOU Qi1
(1Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;2Department of Hepatobiliary Surgery，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450000，China.E-mail: hnzhouqi @163.com; gzbobsums@ gmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of microRNA145 (miRNA145) on the viability，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma HepG2 cells.METHODS: HepG2 cells were randomly allocated into 3 groups: blank control group，empty mimic transfected group and miRNA145 mimic transfected group.Under the induction of LipofectamineTM2000，the recombinant was transfected into HepG2 cells.After transfection，the expression level of miRNA145 was detected by real-time PCR.The protein level of N-cadherin and the mRNA expression levels of miRNA145 and N-cadherin were detected by Western blot and real-time PCR.The cell viability was detected by MTS assay.The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.Invasion and metastasis were detected by Transwell assay.RESULTS: Compared with negative control，miRNA145 expression was up-regulated significantly，while the expression of N-cadherin was down-regulated significantly.Meanwhile，the cell viability，cell cycle，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma HepG2 cells were all significantly inhibited (P＜0.05).CONCLUSION: miRNA145 dramatically inhibits viability，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma cells.

［KEY WORDS］MicroRNA145; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Apoptosis; Cell invasion

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是癌症中致死率较高的一种，尽管在过去的几十年中，肝癌的各治疗手段取得了显著的进步，但患者的5年生存率仍然较低［1］，这与HCC具有较高的增殖侵袭迁移能力有关。微小RNA (mircroRNA，miRNA)是近年来新发现的、广泛存在于真核生物体内的一类保守的非编码单链小分子RNA，长度约22个核苷酸，主要通过与靶mRNA的3’UTR完全或不完全碱基配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而调控靶基因的表达，调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化［2］。严斌等［3］研究发现，miRNA145在肝癌细胞及肝癌组织中的低表达，可能与HCC的发生发展密切相关。近年来随着研究的不断深入，miRNA145在多种恶性肿瘤中，如直肠癌、膀胱癌［4-6］等，通过对各目标蛋白的控制来调节肿瘤的生长、增殖、凋亡和侵袭能力。本实验就miRNA145对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的影响做初步探讨。

材料和方法

1主要材料

人肝癌细胞株HepG2由中山大学附属第一医院外科实验室提供。

细胞培养基DMEM和胎牛血清购自HyClone; miR145模拟物购自广州锐博生物科技有限公司; LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂购于Invitrogen; Opti-MEM培养基购于Gibco;单溶液细胞增殖检测试剂购于Promega;细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于KeyGEN; N-钙黏蛋白(N-cadherin)兔抗人多克隆抗体购于CST; II抗用武汉博士德生物工程有限公司的过氧化物酶标记羊抗兔IgG。

2主要方法

2.1细胞培养和转染HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，1～2 d换液1次。取对数生长期细胞接种于6孔板，设置空白对照组(control)、空模拟物转染组即阴性对照组(negative control-miRNA145，NC-miRNA145)和miRNA145模拟物(miRNA145-mimic)转染组。基因转染步骤按LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂盒说明书进行，转染后24 h荧光显微镜下根据荧光蛋白的表达观察转染效率。

2.2 Real-time PCR检测细胞miRNA145及N-钙黏蛋白的表达转染后36 h收集各组细胞，按TRIzol法提取细胞总RNA，用分光光度计和琼脂糖凝胶检测总RNA纯度和完整性。总RNA用逆转录反应合成cDNA后，用SYBR Green qPCR Super Mix和SYBR Green microRNA Assay Kit检测样本中的miR NA145含量。采用的miRNA145正向引物为5’-AC ACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGAA-3’，反向引物为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’; N-cadherin的正向引物为5’-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3’，反向引物为5’-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3’;内参照U6的正向引物为5’- CTCGCTTCG GCAGCACA-3’，反向引物为5’-AACGCTTCA-CGAA TTTGCGT-3’。反应条件50℃2 min;95℃2 min;95 ℃15 s，60℃32 s，40循环。反应结束后得到各个标本和内参照U6的基本循环数(Ct值)。根据公式计算目的基因相对含量(RQ值)，即为RNA相对含量，实验重复3次。

2.3 Western blot验证N-钙黏蛋白的表达各组细胞用PBS洗涤后低速离心后弃去上清，加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上充分裂解细胞30 min离心后，取上清到新的EP管中。用BCA蛋白定量试剂盒分别测定各组细胞提取的总蛋白浓度后行SDSPAGE，180 mA恒流转移蛋白至醋酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入I抗，4℃摇床孵育过夜，封闭液洗涤3次分别加入HRP标记II抗，室温下温育1 h，发光试剂作用后，暗室曝光，经显影、定影处理后，以GAPDH作为内参照。用ImageJ软件分析各蛋白区带的灰度值，并用各组细胞所得的灰度值与GAPDH蛋白对应区带的灰度值比较分析蛋白的表达量。

2.4 MTS实验检测细胞活力以每孔1×104个接种于96孔板，转染后收集各组细胞，每组分为0、12、24、48和72 h 5个时点，每个时点设置3个复孔。细胞贴壁后，每孔加入10 μL MTS孵育4 h，酶标仪读板，MTS检测读取490 nm波长处吸光度(A)值，检测3组细胞不同时间存活情况，绘制细胞存活曲线。

2.5流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率转染后收集各组细胞，制成单细胞悬液，PBS洗涤2次，70%的乙醇固定过夜。按试剂盒操作说明书指导加相应试剂，4℃避光放置30 min，流式细胞仪检测各组细胞周期;同样方法收集、洗涤细胞，无须乙醇固定，按操作说明采用Annexin V/PI双染，避光放置10 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

2.6 Transwell法检测细胞的侵袭转移能力转染后收集各组细胞，无血清DMEM培养基制成单细胞悬液(1×105)加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培养基。37℃、5% CO2孵育24、48 h分别取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min，检测细胞是否穿过小孔，若细胞穿过，则立即终止所有实验组，拍照并统计。同样方法收集单细胞悬液，加入到预先用Matrigel凝固过的Transwell小室中，37℃、5% CO2孵育48 h后取出小室，多聚甲醛固定染色，拍照统计。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行t检验及单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1荧光显微镜下观察转染率

miRNA145-mimic组、NC-miRNA145组经转染24 h后，于倒置荧光显微镜下观测各组细胞荧光表达，转染效率均在70%以上，而control组未见荧光表达，见图1。

Figure 1.Observation of transfection efficiency under the fluorescence microscope (×200).图1荧光显微镜下观察转染效率

2 Real-time PCR转染后miRNA145的表达情况

分别提取miRNA145-mimic、NC-miRNA145和control组的HepG2细胞的总RNA，检测总RNA纯度和完整性，可见5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA的条带明亮、清晰、边缘锐利，且28S的亮度大约是18S的2倍以上，说明所提取的总RNA有较好的完整性，见图2。对RNA样品进行紫外分光光度分析(A260/A280=1.9)，表明RNA具有较高的纯度。后通过逆转录得到相应cDNA，以其作为模板对miRNA145和N-钙黏蛋白进行扩增，在mRNA水平分别检测各组miRNA145和N-钙黏蛋白表达情况的差异。结果发现，转染miRNA145模拟物的HepG2细胞的miRNA145表达比转染NC-miRNA145和未转染的HepG2细胞明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。N-钙黏蛋白基因在转染miRNA145模拟物的HepG2细胞的表达比转染NC-miRNA145和未转染的HepG2细胞明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

3 Western blot法验证转染后N-钙黏蛋白的表达情况

分别提取3组HepG2细胞的总蛋白，用Western blot比较3组miRNA145蛋白表达水平的差异，结果显示，转染miRNA145模拟物的HepG2细胞，其N-钙黏蛋白表达水平比转染空模拟物组和未转染组的HepG2细胞明显减少(P＜0.05)，结果与PCR结果一致，见图4。

4转染miRNA145对肝癌细胞活力的抑制作用

细胞在490 nm处吸光度越高，表明其细胞活性越高。如表1所示，在第2、3天时转染组A值显著低于对照组(P＜0.05)。通过MTS实验，将各组A值的均值绘制成曲线，反映各个时点细胞的活性情况，发现在第2、3天时，转染组细胞活性显著低于空白对照组和空载体转染组(P＜0.05)，见图5。

Figure 2.Result of the total RNA electrophoresis.图2各组细胞的总RNA琼脂糖凝胶电泳图

Figure 3.Real-time PCR analysis of miRNA145 and N-cadherin expression 36 h after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图3 Real-time PCR定量分析miRNA145及N-cadherin在各组细胞中的表达

Figure 4.Western blot analysis of N-cadherin expression 36 h after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图4 Western blot分析各组N-钙黏蛋白的表达情况

5转染后各组细胞的细胞周期及凋亡率的变化

空白对照组、空载体转染组和miRNA145质粒转染组G1期峰细胞比例分别为64.75%、65.93%和 70.04%，miRNA145质粒转染组G1期的细胞数目明显增加(P＜0.05)，见图6;3组细胞的总凋亡率分别为3.22%、3.31%和4.78%，miRNA145质粒转染组与空白对照组和空载体转染组相比较细胞凋亡率增加(P＜0.05)，见图7。

Figure 5.The effect of miRNA145 on the viability of hepatoma cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图5 MTS实验分析miRNA145对人肝癌细胞活力的影响

表1　 miRNA145对肝癌细胞不同时点细胞活力的作用Table 1.The effect of miRNA145 on the viability of hepatoma cells at different time points (Mean±SD.n=3)

6转染后细胞的侵袭转移能力

Transwell体外迁移实验结果，显微镜下计下室细胞个数并拍照，每种细胞每次随机选取10个视野计数后取平均值绘制条形图，转染miRNA145的HepG2穿膜细胞数较转染空模拟物的HepG2穿膜细胞数明显减少(P＜0.05)，见图8。

Transwell体外侵袭实验结果，显微镜下计穿出细胞个数并拍照，每种细胞每次随机选取10个视野计数后取平均值绘制条形图，转染miRNA145的HepG2穿膜细胞数较转染空模拟物的HepG2穿膜细胞数明显减少(P＜0.05)，见图9。

讨论

Figure 6.The cell cycle of the HepG2 cells in each group after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图6流式细胞仪检测转染后3组细胞的G1期峰细胞比例情况

Figure 7.The apoptotic rate of the HepG2 cells in each group after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图7流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡率的变化

HCC恶性程度高，预后差，即使采用手术联合化疗的治疗方案，治疗效果仍不佳，术后HCC高复发率和转移是影响患者治疗效果和预后的关键因素，迫切需要寻求新的有效的治疗靶点。miRNA具有广泛的基因调节功能，能对基因活动的各个环节进行调节，参与一系列的生物学进程如胚胎的发育、细胞增殖、细胞凋亡和能量代谢等［7］。已有学者证实miRNA在肝癌的发生、发展过程中发挥癌基因或抑癌基因样的作用(如miRNA-181b)［8］;另肝癌的生物学行为和一些miRNA家族成员(如miRNA-155、miRNA-101)有密切的关系［9］。

Figure 8.The results of Transwell metastatic test showed the metastatic ability of HepG2 cells (×200).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图8 Transwell体外迁移实验

Figure 9.The results of Transwell invasion test showed the invasive ability of HepG2 cells (×200).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图9 Transwell侵袭实验结果

miRNA145是近年来新发现的一类具有肿瘤抑制作用的microRNA，可在多种组织中广泛表达。2003年Michael等［10］首先在人结肠肿瘤中发现miRNA145低表达，认为其可能与肿瘤发生密切相关。miRNA145定位于5号染色体(5q32-33)，其附近的5q31是一个非常重要的脆性位点。脆性位点通常在体细胞中稳定，但在许多肿瘤细胞中经常发生缺失或重排。位于脆性位点附近的miRNA145已被证实在多种肿瘤组织中低表达。研究发现在膀胱癌及直肠癌中，miRNA145目标作用于N-钙黏蛋白、波形蛋白(vimentin)等可抑制恶性肿瘤细胞的上皮间质转化［6，11］。Sachdeva等［12］研究发现miRNA145除具有肿瘤生长抑制作用外，而且对肿瘤细胞的侵袭转移能力有明显的抑制作用。目前越来越多研究结果显示miRNA145具有调控多个靶基因，尤其是N-cadherin、vimentin等肿瘤细胞上皮间质转化基因，可以通过调节这些靶基因从而影响细胞的间质转化，抑制其侵袭转移［11］。

严斌等［3］研究发现通过对临床标本的检测发现miRNA145在肝癌中的表达显著低于正常组织及癌周组织，这与Varnholt等［13］的研究结果一致，提示该小分子RNA在肝细胞癌的发生发展过程中起着负调控的作用。

为了探索miRNA145在肝细胞癌中的作用机制，在本研究中，我们通过转染技术在HepG2细胞中高表达miRNA145，首次发现在肝细胞癌中miRNA145作用于N-cadherin基因，并通过real-time PCR 及Western blot验证其发挥抑制N-cadherin表达作用。随后在Transwell侵袭转移实验中，我们发现转染组细胞的侵袭迁移能力明显减弱，穿膜细胞下降。这些结果提示miRNA145可以通过改变肿瘤细胞表面的黏附分子表达(如调控上皮间质转化过程)而抑制肝癌细胞的迁移侵袭。于此同时，在MTS实验中，我们发现转染组的存活细胞显著少于空白对照组，随后通过流式细胞仪对各组细胞的周期和凋亡率进行分析，发现miRNA145表达增高可以使细胞周期停止在G1期;且转染组细胞的凋亡数目及凋亡率均显著增高。由此，我们认为miRNA145能够抑制肝细胞癌的细胞周期进展、迁移侵袭，最终导致肿瘤细胞凋亡的增加。那么miRNA145可以靶向作用于N-cadherin，是否也能作用于其它黏附分子基因呢? miRNA145是通过什么具体作用机制抑制肝细胞癌的周期进展呢?这些都尚待进一步的研究。目前对肝癌仍采取以手术切除为主的治疗方法，而术后出现复发和转移是患者治疗失败和死亡的主要原因。miRNA介导肿瘤分子治疗将可能成为根治肿瘤的重要发展方向。鉴于miRNA145在肿瘤中的抑癌基因作用，可通过上调miRNA145表达，抑制肿瘤细胞上皮间质转化的能力，从而减少肿瘤耐药，实现抑制肿瘤生长和侵袭转移的治疗目的。但这个设想离临床应用尚远，仍需进一步探索肝癌中miRNA145的生物学意义，miRNA145与靶基因相互作用机制miRNA安全性问题的研究。

综上所述，上调miRNA145能明显降低人肝癌细胞的生长、侵袭转移能力，促进细胞凋亡。随着人们对靶向治疗肝细胞癌的需求不断提高，miRNA145调控肝细胞癌的临床价值令人充满期待。

［参考文献］

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2) : 69-90.

［2］Volk N，Shomron N.Versatility of microRNA biogenesis ［J］.PLoS One，2011，6(5) : e19391.

［3］严斌，李艳兵，吕兴，等.Mir-145在肝癌细胞及肝癌组织中的表达及其意义［J］.中华实验外科杂志，2011，28(5) : 707-709.

［4］Chen X，Gong J，Zeng H，et al.MicroRNA145 targets BNIP3 and suppresses prostate cancer progression［J］.Cancer Res，2010，70(7) : 2728-2738.

［5］Shi B，Sepp-Lorenzino L，Prisco M，et al.Micro RNA 145 targets the insulin receptor substrate-1 and inhibits the growth of colon cancer cells［J］.J Biol Chem，2007，282 (45) : 32582-32590.

［6］Singh N，Liu G，Chakrabarty S.Isolation and characterization of calcium sensing receptor null cells: a highly malignant and drug resistant phenotype of colon cancer ［J］.Int J Cancer，2013，132(9) : 1996-2005.

［7］Esquela-Kerscher A，Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(4) : 259-269.

［8］赵文健，杨亮，李坚，等.miR-181b对肝癌HepG2细胞增殖以及Bcl-2和SP1蛋白表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26(11) : 2106-2111.

［9］Xu LB，Beckebaum S，Iacob S，et al.MicroRNA-101 inhibits human hepatocellular carcinoma progression through EZH2 downregulation and increased cytostatic drug sensitivity［J］.J Hepatol，2014，60(3) : 590-598.

［10］Michael MZ，Sm OC，Van Holst Pellekaan NG，et al.Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia［J］.Mol Cancer Res，2003，1(12) : 882-891.

［11］Ren D，Wang M，Guo W，et al.Wild-type p53 suppresses the epithelial-mesenchymal transition and stemness in PC-3 prostate cancer cells by modulating miR145［J］.Int J Oncol，2013，42(4) : 1473-1481.

［12］Sachdeva M，Mo YY.MicroRNA-145 suppresses cell invasion and metastasis by directly targeting mucin 1［J］.Cancer Res，2010，70(1) : 378-387.

［13］Varnholt H，Drebber U，Schulze F，et al.MicroRNA gene expression profile of hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，47(4) : 1223-1232.

通讯作者△Tel: 020-87755766;周奇E-mail: hnzhouqi@163.com;陈东E-mail: gzbobsums@ gmail.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81402504) ;广东省科技计划(No.2012B061700090) ;广州市科技计划(No.201300000187) ;大亚湾科技计划(No.2013A01016; No.2014A01012)

［收稿日期］2015-03-30

［文章编号］1000-4718(2015)06-1019-07

［中图分类号］R730.23

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.010