高血压与2型糖尿病协同作用导致小鼠心功能障碍和心肌重塑

黄美松，刘　鹏，陈立兵，胡阳黔△(十堰市中西医结合医院内分泌科，湖北十堰440;湖北医药学院附属东风医院消化内科，湖北十堰44008)



高血压与2型糖尿病协同作用导致小鼠心功能障碍和心肌重塑

黄美松1，刘鹏2，陈立兵1，胡阳黔2△
(1十堰市中西医结合医院内分泌科，湖北十堰442011;2湖北医药学院附属东风医院消化内科，湖北十堰442008)

［摘要］目的:研究高血压与2型糖尿病联合作用是否能导致小鼠心功能障碍和心肌重塑。方法:将14周龄的2型糖尿病和非糖尿病小鼠经血管紧张素II(Ang II)给药4周诱导小鼠形成轻度高血压。运用超声波心动描记术和多巴酚丁胺负荷试验评价小鼠左心室功能; HE染色分析左心室心肌细胞的肥大作用; Western blotting测定心肌组织中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的表达水平。结果:与非糖尿病小鼠比较，糖尿病小鼠(DM 组)的心脏功能和心肌结构无明显变化; Ang II给药不影响2型糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠的体重和血糖含量，但血压明显增高;左心室重量和心肌细胞表面积结果分析显示，Ang II诱导2型糖尿病小鼠的左心室肥大程度显著大于Ang II组; Ang II给药的2型糖尿病小鼠左心室的缩短分数和射血分数显著降低，而Ang II组小鼠无明显变化; Western blotting结果显示Ang II组、DM组和DM+ Ang II组小鼠左心室组织中p-AMPK的表达量显著降低。结论: 2型糖尿病小鼠心脏功能和心肌结构无明显变化，当高血压存在时2型糖尿病小鼠容易发生心脏功能障碍和心肌重塑，提示高血压是2型糖尿病小鼠心脏功能障碍和心肌重塑的关键因子。

［关键词］2型糖尿病;心功能障碍;心肌重塑;心肌肥大;血管紧张素II

［修回日期］2014-12-08

Synergistic effect of hypertension and type 2 diabetes on cardiac dysfunction and myocardial remodeling in mice

HUANG Mei-song1，LIU Peng2，CHEN Li-bing1，HU Yang-qian2
(1Department of Endocrinology，Shiyan Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine，Shiyan 442011，China;2Department of Gastroenterology，The Affiliated Dongfeng Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442008，China.E-mail: huyangqian999@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate whether the effect of hypertension combined with diabetic can lead to cardiac dysfunction and myocardial remodeling in mice.METHODS: The diabetic mice and non-diabetic mice of 14 weeks old were administered with PBS or angiotensin II (Ang II) for 4 weeks to induce mild hypertension.The left ventricular (LV) function was assessed by echocardiography and dobutamine stress test.The LV tissues were subjected to HE staining to assess cardiac hypertrophy.The phospharylated adenosine monophosphate-activated protein kinase (p-AMPK) levels in the LV tissues were determined by Western blotting.RESULTS: Compared with control group，diabetic mice (DM group) neither displayed marked cardiac dysfunction nor myocardial remodeling.Ang II treatment did not affect body weight and glucose level，but the blood pressure was increased in the diabetic and control mice.Ang II-induced LV hypertrophy in diabetic mice was significantly higher than that in control mice as assessed by LV masses and cardiomyocyte sizes.Moreover，Ang II-treatment reduced LV fractional shortening and contractility in the diabetic mice，but not in the control mice.The p-AMPK levels were significantly reduced in Ang II group，DM group and DM+ Ang II group.CONCLUSION: The cardiac function and cardiac structure of type 2 diabetic mice did not obviously change.Cardiac dysfunction and myocardial remodeling were easily induced in type 2 diabetic mice when hypertension happened，suggesting that hypertension is a critical factor of cardiac dysfunction and myocardial remodeling in type 2 diabetic mice.

［KEY WORDS］Type 2 diabetes; Cardiac dysfunction; Myocardial remodeling; Cardiac hypertrophy; Angiotensin II

糖尿病(diabetes mellitus，DM)、高血压、血脂异常以及肥胖都是心血管疾病发生之前的相对独立的风险评估因子，其中高血压是最常用的风险因子［1-2］。临床研究发现糖尿病患者一般会伴随着高血压和冠状动脉疾病的发生，从而导致患者心脏功能的衰竭和心脏结构的改变，后一种情况通常称为糖尿病心肌重塑［3-5］。使用的动物模型、动物的年龄以及动物患糖尿病类型(1型糖尿病和2型糖尿病)的不同可能得出不同的研究结果。因此，导致糖尿病动物心脏功能衰竭和心肌重塑的主要原因目前仍没有一致的定论。研究显示，患有2型糖尿病的小鼠心脏功能和结构没有发生明显异常［6-7］，这一结果提示我们单个风险因子如2型糖尿病、高血压或血脂异常不能单独导致心脏功能异常。因此，我们推测2种或2种以上的风险因子同时存在可能是2型糖尿病小鼠心脏功能衰竭和心肌重塑的原因。其次，目前糖尿病动物心脏功能衰竭和心肌重塑的研究仅限于1型糖尿病与高血压之间的关系［8-11］。因此，本研究以2型糖尿病小鼠为研究对象，通过注射低剂量的血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)建立2型糖尿病/高血压小鼠，观察和测定2型糖尿病/高血压小鼠心脏左心室功能的改变和心肌重塑;通过测定心脏组织中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的活性，初步探讨2型糖尿病/高血压小鼠发生心肌重塑潜在的分子机制，为2型糖尿病患者心脏功能衰竭和心肌重塑的临床治疗提供理论依据。

材料和方法

1材料和试剂

非糖尿病BKS-db/+小鼠(以下简称db/+ )和2型糖尿病BKS-db/db小鼠(以下简称db/db)购自南京大学模式动物研究所;血管紧张素II购自Alexis;盐酸多巴酚丁胺购自Sigma;磷酸化AMPK (p-AMPK)单克隆抗体和AMPK单克隆抗体购自Cell Signaling;β-actin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司;生物素酶标记的II抗IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;血管生成素样蛋白4(angiopoietinlike protein 4，Angptl4)和解偶联蛋白3(uncoupling protein 3，UCP3)的ELISA试剂盒购自武汉华美生物技术公司。

2方法

2.1动物实验分组实验动物分为4组，分别为: Ang II组(注射Ang II的db/+小鼠) ; DM+ Ang II 组(Ang II的db/db小鼠) ; control组(注射PBS的db/+小鼠) ; DM组(注射PBS的db/db小鼠)。Ang II溶解于无菌PBS中，通过皮下注射给药(1 mg · kg－1·d－1)。每组10只小鼠，饲养温度控制在22～ 25℃之间，相对湿度控制在50%～60%之间;每日12 h交替光照，昼夜循环，自由进食、饮水。

14周龄的小鼠在注射Ang II的前后运用尾袖测量法测定大鼠在清醒状态下的尾动脉收缩压和舒张压。注射Ang II后每隔1周从每组中随机挑选2只小鼠，从隐静脉中收集血液样本，运用血糖测量仪测量血糖水平;第18周结束后，所有的小鼠经麻醉后通过多巴酚丁胺负荷试验评估它们的左心室功能;随后小鼠被处死，取出各器官用于后续实验。

2.2超声心动描记术检测心功能将14、16和18周的小鼠经2%异氟醚麻醉，运用超声心动描记术测定小鼠的心脏大小和功能，在心脏舒张和收缩过程中测定左心室壁厚、左心室内径、左心室的长度和面积以及心率。针对这些参数计算并比较左心室整体功能指标，包括左心室缩短分数(fractional shortening，FS)、射血分数(ejection fraction，EF)、舒张末期容量(end-diastolic volume，EDV)、收缩末期容量(end-systolic volume，ESV)以及心输出量(CO)。同时，运用声波多普勒效应测定舒张早期二尖瓣血流速度(E)和舒张晚期二尖瓣血流速度(A)的比值(E/A)来评价心室的舒张功能。

2.3多巴酚丁胺负荷试验Ang II给药第4周，通过测定多巴酚丁胺注射前后心脏收缩压和舒张压来评估心脏所承受的工作负荷［7］。将8道生理记录压力传感器与动脉导管连接，小鼠用尿烷(2.5 mg/g)麻醉后将导管经右颈动脉插入左心室空腔中，将另一根导管插入颈静脉后注射不同剂量的多巴酚丁胺(0、100、200、300、400、500 ng/min，2 min/次)，测定注射前后心脏的最大正压(pPmax)和最大负压(nPmax)。

2.4 HE染色多巴酚丁胺诱导心脏压力测试完成之后，麻醉的小鼠立刻经腹主动脉放血致死，分离心脏、肝、肺和肾，称重后用于后续实验。运用游标卡尺测量其胫骨长度，将心房、右心室(right ventricle，RV)和左心室(left ventricle，LV)从心脏中分离出来。为了测定心肌细胞的表面积，一部分LV经4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋和切片。获得的组织切片经固定、脱蜡、脱水、HE染色，随机选择3个视野进行拍照。运用全自动形态测量仪测量左心室心肌细胞表面积，每张片测量5次并计算其平均值。

2.5 Western blotting和ELISA检测左心室组织置于预冷的含有蛋白酶抑制剂(0.5 mmol/L PMSF，1 mg/L亮抑蛋白酶肽，1 mg/L胃酶抑素)的裂解缓冲液中匀浆，4℃12 000 r/min离心10 min，收集上清，按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。将总蛋白50 μg进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，孵育I抗(p-AMPK抗体1∶500; AMPK抗体1∶1 000;β-actin抗体1∶1 000)，4℃过夜。TBST洗膜，加入生物素标记的兔抗鼠IgG(1∶2 000)室温孵育1 h。膜经ECL发光后扫描，蛋白表达灰度值经Quanity One软件分析。同时利用ELISA检测试剂盒检测各组左心室组织匀浆上清总蛋白中Angptl 4和UCP3的表达。

3统计学处理

运用SPSS 17.0统计软件进行相关数据分析，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1小鼠形态特征

与非糖尿病小鼠比较，14、16和18周的2型糖尿病小鼠的体重和血糖含量显著增加(P＜0.05)，Ang II对db/+和db/db小鼠的体重和血糖含量无明显影响;与control组比较，DM组的胫骨长度稍微缩短，但差异无统计学意义(P＞0.05)，而肝脏重量显著增加(P＜0.01)，见表1。当用Ang II给药4周后，与DM组小鼠比较，DM+ Ang II组小鼠的肝脏重量明显增加(P＜0.01)，而肾脏重量明显降低(P＜0.05) ;此时，db/db小鼠的体重、胫骨、肝脏重量和血糖含量无显著变化，提示Ang II不影响db/db小鼠体重且与糖尿病严重程度无关，见图1、表1。

2心脏功能

Control组和DM组小鼠的血压无明显变化; Ang II给药之后Ang II和DM+ Ang II小鼠的血压显著升高(P＜0.05)，且升高的趋势基本相同; AngII对14周的小鼠血压无明显变化。Ang II给药4周时，db/+小鼠的左心室功能不受影响;与control组小鼠比较，Ang II小鼠的心率、射血分数、缩短分数、左心室舒张末期容量、左心室收缩末期容量、心搏量以及心输出量无明显变化，见图1、表2。

Ang II给药4周时，DM小鼠的左心室缩短分数显著高于control小鼠(P＜0.05)，Ang II对db/+小鼠的左心室缩短分数无影响;但是，DM+ Ang II小鼠的左心室缩短分数明显低于DM小鼠(P＜0.05)。无论db/+小鼠还是db/db小鼠，这4组小鼠之间的射血分数不存在显著差异，见图2。

Figure 1.The effects of Ang II treatment on body weight，blood glucose level and blood pressure of diabetic and nondiabetic mice.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs Ang II group;△P＜0.05 vs DM group.图1 Ang II对糖尿病和非糖尿病小鼠体重、血糖含量和血压的影响

表1　非糖尿病小鼠和2型糖尿病小鼠经Ang II给药4周后的形态特征Table 1.Morphometric characteristics of non-diabetic and diabetic mice treated with Ang II for 4 weeks (Mean±SD.n=6)

表2　非糖尿病小鼠和II型糖尿病小鼠经Ang II给药后心脏大小和功能的变化Table 2.The changes of cardiac dimensions and functions in non-diabetic and diabetic mice treated with Ang II (Mean±SD.n=6)

Figure 2.The effects of Ang II treatment on left ventricular fractional shortening and ejection fraction of diabetic and non-diabetic mice.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs Ang II group;△△P＜0.01 vs DM group.图2 Ang II对糖尿病和非糖尿病小鼠左心室的缩短分数和射血分数的影响

随着多巴酚丁胺浓度的增加，4组小鼠心率和左心室收缩压增加的幅度基本相同，无显著差异(P＞0.05)。pPmax和nPmax随着多巴酚丁胺浓度的增加逐渐升高，但是DM+ Ang II组小鼠的pPmax增高的趋势比DM组小鼠弱。暴露低剂量的多巴酚丁胺后，Ang II组、DM组和DM+ Ang II组小鼠的nPmax显著低于control组小鼠(P＜0.05)，提示糖尿病和高血压对减缓小鼠心脏收缩具有相同的功能。但是，高剂量的多巴酚丁胺对4组小鼠的nPmax变化无明显影响，见图3。

3心肌重塑

DM组和control组小鼠心脏和左心室的重量无明显变化;但是Ang II作用后DM+ Ang II组和Ang II组小鼠心脏和左心室的重量明显增加，且DM+ Ang II组小鼠心脏和左心室重量的增加值大于Ang II组小鼠(表1) ; DM+ Ang II组小鼠左心室重量与胫骨长度的比值显著大于Ang II组小鼠(图4)。超声心动描记术结果分析显示，Ang II给药第16周和18周时，DM+ Ang II组小鼠的舒张期左心室壁厚度显著增加，Ang II组小鼠的舒张期左心室壁厚度与control组比较无显著差异(P＞0.05)，见图4、表2。此外，与Ang II组小鼠比较，DM+ Ang II组小鼠心肌细胞的表面积显著增加，见图4。

4 Angptl4和UCP3蛋白表达变化

ELISA结果发现糖尿病小鼠心脏中的Angptl4 和UCP3的表达水平明显高于非糖尿病小鼠，当Ang II给药后，2型糖尿病小鼠心脏中的Angptl4和UCP3的表达水平增高。然而，Angptl4和UCP3在非糖尿病小鼠心脏中的表达变化无显著差异，见表3。

Western blotting结果显示，DM组和DM+ Ang II组小鼠心脏中p-AMPK的水平显著低于control组和Ang II组小鼠，Ang II组小鼠心脏中p-AMPK的水平较control组低，但差异无统计学意义，见图5。

讨论

Figure 3.The effects of dobutamine stimulation on left ventricular functions of non-diabetic and diabetic mice treated with Ang II.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs Ang II group;△△P＜0.01 vs DM group.图3糖尿病和非糖尿病小鼠经AngII处理后多巴酚丁胺注射对其左心室功能的影响

Figure 4.AngII-induced hypertension triggered cardiac hypertrophy in diabetic mice.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs AngⅡgroup;△△P＜0.01 vs DM group.图4 Ang II诱导的糖尿病小鼠高血压导致小鼠心肌肥大

本文以14～18周龄的2型糖尿病小鼠为研究对象，通过Ang II给药后建立2型糖尿病/高血压小鼠，研究2型糖尿病和高血压2种心血管疾病风险因子对小鼠的心脏功能和结构的影响。结果显示2型糖尿病小鼠的心脏功能和结构无明显变化，但是2型糖尿病小鼠发生心肌肥大进而引起小鼠血压小幅度升高，而2型糖尿病小鼠在高血压存在的条件下其心脏功能和结构发生了显著变化。有研究表明1型糖尿病和高血压是心血管疾病诊断过程中相对独立的风险因子，但两者在心肌肥大、心脏功能障碍和心肌纤维化过程中具有协同作用［8-11］。Falco-Pires等［9］以1型糖尿病/高血压小鼠为模型研究其心脏功能的变化，发现1型糖尿病能导致小鼠左心室硬化，而高血压引起心肌细胞肥大，两者共同作用最终导致心脏舒张功能不全。我们的研究结果显示2型糖尿病对小鼠心脏功能无明显变化，但2型糖尿病和AngII共同作用却能加速小鼠的心肌重塑。

2型糖尿病小鼠和2型糖尿病患者有着共同的病理特征，例如肥胖、血脂异常、胰岛素抗性和高血糖［7，12-13］。研究发现血压正常的2型糖尿病小鼠其左心室缩短分数偏高，与高血压2型糖尿病比较，血压正常的2型糖尿病小鼠心脏收缩功能没有下降［14］。另有研究发现，长期患有2型糖尿病的小鼠发生低程度的心肌纤维化，而心脏功能正常和无心肌肥大效应［6］。这一研究结果表明2型糖尿病不能导致小鼠心脏功能异常和心肌重塑，因此，本研究采用2型糖尿病和高血压同时存在下观察小鼠心脏功能和心肌重塑的变化情况。结果显示，2型糖尿病小鼠经Ang II作用后血压明显升高，心肌细胞肥大显著;非糖尿病小鼠经Ang II注射后其血压和心脏功能不发生明显变化，提示2型糖尿病和高血压协同作用导致小鼠心脏功能的异常和心肌重塑。本研究运用多个指标来评价心肌肥大的程度(左心室的重量、超声波心动描记术和HE染色)，我们的结果显示2型糖尿病本身不能导致小鼠心肌肥大。但是，Ang II诱导2型糖尿病小鼠形成高血压后，2型糖尿病/高血压小鼠容易发生心肌肥大，而2型糖尿病/高血压小鼠容易导致心肌肥大的原因仍需深入研究。

表3　 ELISA检测Ang II对糖尿病和非糖尿病小鼠心脏中AngPtl4和UCP3蛋白表达的影响Table 3.The effects of Ang II on heart AngPtl4 and UCP3 protein expression in non-diabetic and diabetic mice detected by ELISA (ng/L.Mean±SD.n=6)

Figure 5.Western blotting determined the effect of Ang II on cardiac p-AMPK levels in non-diabetic and diabetic mice.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs AngⅡgroup;△△P＜0.01 vs DM group.图5 Western blotting测定Ang II对糖尿病和非糖尿病小鼠心肌组织中p-AMPK水平的变化

Angptl4和UCP3是与心脏代谢相关的重要蛋白，研究表明其分泌含量变化能够直接影响生物体心脏功能，而糖尿病个体心肌组织中Angptl4和UCP3表达水平会显著升高［7，15］。本研究中Ang II给药对照组心肌组织中Angptl4和UCP3表达水平变化不明显，但Ang II给药糖尿病组小鼠心肌组织中Angptl4和UCP3表达水平均显著上升，再次说明高血压因素和糖尿病因素协同作用时会影响小鼠心肌功能。有研究表明AMPK活性在心肌肥大过程中有着重要作用［16-17］。因此，本文探讨了心肌重塑与心脏代谢相关蛋白表达之间的关系，尤其是心肌组织中AMPK的活性对心肌重塑的影响。我们的研究结果显示，Ang II给药后，糖尿病小鼠心肌组织中AMPK的磷酸化程度降低，即AMPK的活性下降。最新的研究发现AMPK的活性在瘦素和LDL受体表达缺失的小鼠以及代谢综合症小鼠的心肌重塑中发挥重要作用［18］。这些研究结果提示，降低AMPK的活性增加糖尿病患者心脏对高血压诱导的心肌膨胀的敏感性，从而抑制了心肌肥大的发生。

综上所述，本研究在对2型糖尿病小鼠的研究中发现，单独的2型糖尿病不能导致小鼠心功能障碍和心肌重塑，但是当其与高血压联合作用时，2型糖尿病小鼠容易导致心功能障碍和心肌重塑。研究还发现2型糖尿病/高血压小鼠心肌组织中AMPK的磷酸化程度显著降低，提示心肌组织中AMPK的活性变化是糖尿病小鼠发生心肌肥大的主要原因，其具体的分子机制仍需进一步研究。

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通讯作者△Tel: 0719-8272546; E-mail: huyangqian999@163.com

*［基金项目］湖北省教育厅指导项目(No.B2014054)

［收稿日期］2014-11-18

［文章编号］1000-4718(2015)06-0988-07

［中图分类号］R363.1+4

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.005