间充质干细胞条件培养基激活Nrf2/ARE通路对抗H2O2致H9c2细胞的氧化应激损伤*

董　曦，孙桂波，罗　云，陈素红，孙晓波

(1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193;2温州医科大学药学院，浙江温州325035)



间充质干细胞条件培养基激活Nrf2/ARE通路对抗H2O2致H9c2细胞的氧化应激损伤*

董曦1，2，孙桂波1△，罗云1，陈素红2，孙晓波1△

(1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193;2温州医科大学药学院，浙江温州325035)

［摘要］目的:探讨间充质干细胞(MSC)条件培养基(MSCCM)对氧化应激损伤的心肌细胞的保护作用及机制。方法:用流式细胞术对MSC进行鉴定，再用MTT实验确定MSCCM对抗H2O2氧化应激损伤的最佳孵育时间。将H9c2细胞分为正常组、模型组、模型+ MSCCM组和MSCCM组。模型+ MSCCM组和MSCCM组均用MSCCM进行预孵育24 h，模型组和模型+ MSCCM组用浓度为300 μmol/L的H2O2作用4 h模拟心肌细胞的氧化应激损伤。利用流式细胞术检测损伤后心肌细胞的线粒体膜电位变化、凋亡比率等指标，通过荧光显微镜检测细胞ROS产生的变化，Western blot检测Nrf2/ARE通路的相关蛋白表达。结果: MSCCM组心肌细胞的线粒体膜电位、凋亡比率和ROS产生与正常组相比均无显著差异(P＞0.05) ;模型+ MSCCM组的线粒体膜电位、凋亡比例和ROS产生与模型组相比差异显著(P＜0.01) ;在0 h到24 h这段时间内，心肌细胞Nrf2/ARE通路中的Nrf2核转位与HO-1表达均随着MSCCM孵育时间延长而增加。结论: MSCCM可以保护心肌细胞，对抗H2O2诱导的氧化应激损伤，其机制可能与激活Nrf2/ARE通路有关。

［关键词］间充质干细胞;条件培养基;心肌细胞;氧化应激

［修回日期］2015-03-25

MSC-conditioned medium activates Nrf2/ARE pathway to protect H9c2 cells against oxidative stress

DONG Xi1，2，SUN Gui-bo1，LUO Yun1，CHEN Su-hong2，SUN Xiao-bo1
(1Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China;2School of Pharmaceutical Sciences，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: sunguibo@126.com; sun-xiaobo@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the protective effect of mesenchymal stem cell (MSC) -conditioned medium (MSCCM) on myocardial cell line H9c2 and its mechanism.METHODS: Verification of MSC was performed by flow cytometry analysis，followed by MTT assay to determine the optimal incubation time of MSCCM with myocardial cells.The cells were divided into 4 groups: normal (N) group，model (M) group，M+ MSCCM group and MSCCM group.The cells in M+ MSCCM group and MSCCM group were pre-incubated with MSCCM for 24 h.The cells in M group and M+ MSCCM group were treated with 300 μmol/L H2O2for 4 h to imitate oxidative injury of myocardial cells.Mitochondrial membrane potential and apoptotic rate of injured myocardial cells were detected by flow cytometry.The ROS production was measured by fluorescence microscopy.The nuclear translocation of Nrf2 and expression of HO-1 was examined by Western blot.RESULTS: No difference of mitochondrial membrane potential，apoptotic rate or ROS production between MSCCM group and N group was observed (P＞0.05).The mitochondrial membrane potential depolarization，apoptotic rate and ROS production in M+ MSCCM group were significantly lower than those in M group (P＜0.01).The nuclear translocation of Nrf2 and expression of HO-1 in the myocardial cells were increased with MSCCM incubation time prolonged.CONCLUSION: MSCCM protects the myocardial cells against oxidative injury induced by H2O2.The anti-oxidative mechanism would be associated with the activation of Nrf2/ARE pathway.

［KEY WORDS］Mesenchymal stem cells; Conditioned medium; Myocardial cells; Oxidative stress

缺血性心脏病是指由于冠状循环改变引起的冠状动脉血流与心肌需求之间不平衡而导致的心肌损伤，又称为冠状动脉粥样硬化性心脏病。缺血性心脏病的基本治疗原则是恢复血流再灌，但当心肌缺血经过一定时期后，即使恢复血流再灌，心肌损伤反有加重，人们称这种现象为心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion，I/R)［1］。在缺血阶段，心脏的血液及养分供给不足，导致心肌细胞的凋亡及坏死。而当血液再灌注至缺血部位，由于氧供给的突然增加，缺血部位会产生过量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，造成该部位的氧化损伤以及心肌细胞死亡［2］。有研究表明，再灌注过程中产生的过量ROS会导致心肌细胞死亡及心脏功能异常［3］。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)具有组织再生、修复以及旺盛的分泌能力，有关MSC的研究已经开展至临床阶段。更有研究指出MSC对心绞痛及心肌梗死等缺血性心脏病有着显著的治疗作用［4-5］。目前研究主要集中在MSC对心脏病的改善，而有证据表明MSC所分泌的因子是发挥修复作用的重要部分［6-7］。MSC条件培养基(MSC-conditioned medium，MSCCM)是指与MSC共孵育一段时间的培养基，MSC条件培养基内含有MSC分泌的各种因子，并被证实对氧化应激造成的损伤有治疗作用［8］。

Nrf2/ARE是细胞抵抗氧化、化学等刺激的防御性转导通路，并在缺血性心脏病中起着重要的治疗作用［9］。在Nrf2/ARE通路中，活化的Nrf2转录因子可以促进细胞Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等的转录，清除过量的ROS，保持细胞内氧化还原状态的平衡，并减轻ROS对细胞的损伤［10］。由于Nrf2通路具有突出的抗氧化作用，以及细胞氧化损伤是缺血性心脏病中重要的致病机制，许多文章都在研究Nrf2通路对于缺血性心脏病中细胞损伤的治疗作用。这些研究结果表明，Nrf2通路可以缓解心肌细胞由于缺血再灌注产生的氧化损伤［11］，降低氧化应激损伤诱导的心肌细胞凋亡［12］，在心肌梗死中保护心肌细胞［13］。

然而，关于MSCCM对心肌细胞的抗氧化保护作用，以及MSCCM对Nrf2/ARE通路的调控的研究还比较少。因此，本研究将通过H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤模型，来探索MSCCM对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用以及其对Nrf2/ARE通路的影响，以期了解MSCCM的作用机制并对临床做出指导。

材料和方法

1实验材料

DMEM培养基购自Gibco; MTT和胰酶购自Amresco; FBS购自四季青公司; ROS检测试剂及凋亡检测试剂购自Invitrogen; JC-1试剂购自ENZO; DMSO购自Sigma;流式抗体CD29、CD73、CD45和CD34购自BD; Western blot I抗Nrf2、HO-1、β-actin和lamin B购自Santa Cruz; Western blot相关II抗购自中杉金桥公司。

2间充质干细胞条件培养基制备

机械法分离人脐带间充质干细胞，无菌条件下分离华通氏胶，剪碎后培养于含10% FBS血清的DMEM培养基中，2周后MSC从华通氏胶中爬出并贴壁，待细胞生长至80%融合时，消化并传代。当细胞生长至3～4代，并80%融合时，向细胞培养皿中加入新鲜无血清培养基，然后收集孵育12 h、24 h和36 h的间充质干细胞条件培养基。

3实验方法

3.1流式细胞术检测间充质干细胞表型取培养至第3代的MSC，300×g离心5 min，弃上清，PBS洗2遍。用100 μL PBS重悬，加入5 μL荧光标记抗体，室温避光孵育20 min，加入1 mL PBS，300×g离心5 min，然后用500 μL PBS重悬，用流式细胞仪检测。

3.2 MTT法检测细胞存活率取第3代的MSC，重悬至1×108/L，铺在96孔平底板中，每孔200 μL。将实验组分为5组，正常组内加入新鲜无血清DMEM培养基，0 h、12 h、24 h、36 h组分别加入新鲜无血清DMEM培养基(即模型组)、12 h间充质干细胞条件培养基、24 h间充质干细胞条件培养基、36 h间充质干细胞条件培养基后与H9c2细胞共孵育24 h。然后向0 h、12 h、24 h、36 h组加入无血清培养基配制的300 μmol/L H2O2并孵育4 h。孵育结束后，吸弃间充质干细胞条件培养基，并加入200 μL(1 g/L) MTT，孵育4 h。然后加入200 μL DMSO，混匀后在570 nm波长下测定吸光度。细胞存活率(%)=(实验组光吸收值/对照组光吸收值)×100%。

3.3流式细胞术检测线粒体膜电位及凋亡取培养至第3代的MSC，重悬至1×108/L，铺在6孔平底板中，每孔2 mL。实验组分为正常(normal，N)组、模型(model，M)组、M+ MSCCM组和MSCCM组。用步骤3.2中确定的最佳时点的MSCCM与M+ MSCCM组及MSCCM组的H9c2细胞共孵育24 h，用300 μmol/L H2O2溶液对模型组与M+ MSCCM组造模，其它2组换成新鲜无血清DMEM。4 h后消化细胞，用无血清DMEM配制的2 μmol/L JC-1探针与各组H9c2细胞于37℃下避光孵育15 min，再用PBS 洗2次，然后用500 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测;利用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，先用试剂盒内的200 μL binding buffer重悬各组细胞，再用5 μL FITC标记的Annexin V工作液与1 μL PI工作液共同孵育细胞悬液15 min，然后用流式细胞仪检测。

3.4荧光显微镜检测细胞内活性氧自由基水平

按照步骤3.3中的方法处理细胞，然后向培养板中加入用无血清DMEM配制的25 μmol/L的ROS探针，与各组H9c2细胞于37℃下避光孵育30 min，再用PBS洗2次。用荧光显微镜进行观察拍照。之后用Image-Pro Plus进行分析。

3.5 Western blot检测细胞内蛋白表达按照步骤3.3中的方法处理各组细胞，用PBS洗涤细胞1次并消化，400×g 10 min离心细胞，并加入细胞裂解液400 μL重悬，于4℃裂解1 h。800×g 15 min离心，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。每组取20 μg的总蛋白，12% SDS-PAGE分离蛋白，用电转移法将蛋白质转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，分别加入兔抗小鼠Nrf2、HO-1、β-actin和lamin B I 抗(均为1∶200稀释)，4℃孵育过夜; TBST溶液洗涤3次，每次15 min，加入辣根素过氧化酶标记的羊抗鼠II抗，室温孵育4 h，TBST溶液洗膜3次，每次15 min，以增强化学发光法显色、曝光，定量测定各条带密度，以β-actin进行校正。

4统计学处理

所有实验均重复3次，数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料先进行正态性检验，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料转成正态分布后再采用单因素方差分析;计数资料采用非参数秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MSC的鉴定

间充质干细胞经过分离并培养至第3代，经鉴定其CD29和CD73表达为阳性，CD34和CD45表达为阴性，符合MSC特征，见图1。

2 MSCCM对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的保护作用

MTT结果显示，孵育24 h的MSCCM对H2O2损伤的H9c2细胞有较好的保护作用，其与0 h相比有统计学意义(P＜0.01) ; 36 h的MSCCM也对H9c2细胞具有保护作用(P＜0.05) ;而其它时点的MSCCM对H2O2损伤的H9c2细胞无明显作用(P＞0.05)，见图1。

Figure 1.Identification of MSC and protective effect of MSCCM on oxidatively injured H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs N group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 h group.图1 MSC的鉴定与MSCCM保护受氧化损伤的H9c2细胞

3 MSCCM对H2O2诱导的H9c2细胞内线粒体膜电位及活性氧自由基水平变化的作用

本研究利用红绿荧光的比例来表示线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)去极化的程度。与模型组相比，MSCCM可显著缓解H9c2细胞的MMP去极化，M+ MSCCM组的红绿荧光比值较模型组显著升高(P＜0.01)，MSCCM组与正常组无显著差异(P＞0.05)。本研究又利用荧光显微镜观察了MSC条件培养基对H2O2诱导H9c2细胞ROS产生的影响。荧光照片结果表明，与模型组相比，M+ MSCCM组的ROS产生显著下降(P＜0.01)，而MSCCM组与正常组无显著差异(P＞0.05)。因此，孵育24 h的MSCCM对于H2O2诱导H9c2细胞的ROS产生和MMP去极化都有抑制作用，见图2。

Figure 2.Protective effect of MSCCM on depolarization of MMP and ROS production in oxidatively injured H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs N group;＊＊P＜0.01 vs M group.图2 MSCCM对氧化损伤的H9c2细胞的线粒体膜电位去极化与ROS产生的影响

4 MSCCM对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响

与模型组相比，M+ MSCCM组的凋亡比例显著降低(P＜0.01)。而与正常组相比，MSCCM组细胞凋亡水平没有显著差异(P＞0.05)，见图3。

5 MSCCM对H9c2细胞抗氧化通路蛋白表达的影响

根据Western blot的结果可知，24 h的MSCCM孵育H9c2细胞不同时间，从4 h到24 h，MSC条件培养基逐渐增加Nrf2的核转位以及抗氧化酶HO-1的表达，见图4。这表明MSCCM对H9c2细胞的保护至少部分是通过Nrf2/ARE通路来发挥作用的。

讨论

在临床上，缺血再灌注是心肌常见的损伤形式。尽管缺血再灌注的病理生理机制还未被完全阐明，氧化损伤被认为是启动缺血再灌注损伤的重要因素。许多前临床研究都指出，抑制ROS的生成可以有效地缓解缺血再灌注损伤［14］。我们的研究表明，MSCCM处理24 h可以保护H9c2细胞，对抗H2O2造成的氧化应激损伤。而其它时点没有改善效果。这可能是由于MSC条件培养基内有效因子还未至起效浓度，或有害物质积累的原因。

氧化应激损伤所造成的严重影响之一是造成线粒体膜渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放。mPTP位于线粒体膜上，其开放程度的改变会引起线粒体膜通透性的改变。当线粒体受到氧化应激损伤后，mPTP开放，引起线粒体膜电位去极化、细胞色素C释放、caspase家族活化及细胞凋亡［15］。线粒体膜电位产生于呼吸氧化过程中，呼吸产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧造成质子及其它离子浓度的不对称分布形成了线粒体膜电位。我们的实验结果表明，MSCCM能够显著降低H9c2细胞线粒体膜电位去极化水平。在氧化应激情况下，ROS会攻击心肌细胞内的生物分子，引起线粒体及细胞核损伤、脂质过氧化等，最终导致突变、蛋白变性。而线粒体损伤又是缺血再灌注后ROS上升的重要原因［16］。MSCCM能够降低M+ MSCCM组的ROS产生，这些结果表明MSCCM可以对抗H2O2的氧化应激损伤，保护心肌细胞线粒体，减少线粒体因损伤而释放的ROS。

细胞凋亡是引起心肌细胞死亡的另一重要机制，同时也是细胞线粒体损伤的后续事件。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞程序性死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一个被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。长期以来，人们普遍认为坏死是心肌细胞死亡的唯一方式，而后续研究则认为凋亡也是心肌细胞死亡的重要原因［17］。在临床上，冠状动脉介入是缺血性心脏病的重要诊疗手段。然而，在冠状动脉介入术后，会发生缺血再灌注损伤，出现一过性低血压、再灌注心律失常、心功能不全、心源性休克甚至是猝死。心肌细胞凋亡则被认为是这些缺血再灌注损伤的重要原因［18］。本研究用Annexin V/PI双染法分析MSCCM对氧化损伤的H9c2细胞的保护作用，结果表明，MSCCM可以缓解心肌细胞的凋亡。这与MSCCM对线粒体的保护作用一起表明，MSCCM可以抑制因氧化应激而造成的依赖于线粒体的细胞凋亡，展现出治疗缺血性心脏病的潜在能力。

MSCCM可激活MAPK及PI3K/Akt通路达到保护作用［19］，本研究则尝试根据MSCCM的抗氧化作用来探索它对Nrf2/ARE通路的影响。Nrf2/ARE通路是抗氧化的重要通路，Nrf2与Keap1以无活性的2聚体形式存在于细胞浆内，当受到外界氧化、化学刺激后，Nrf2与Keap1分离，转位进入细胞核。在细胞核内Nrf2与Maf、抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合并调控抗氧化酶的表达［16，20］。由Western blot的结果可知，随着时间的推移，MSCCM可以促进Nrf2的核转位以及其所调控的抗氧化酶HO-1的表达。这表明MSCCM可以活化Nrf2/ARE通路，并增加其下游抗氧化酶的表达。

综上所述，本研究表明MSCCM可以保护心肌细胞，对抗心肌细胞的氧化应激损伤。目前，有大量的研究工作都集中在MSC对疾病的治疗及组织的修复上，并发展到临床阶段。尽管关于MSCCM的研究已经逐渐走入科研工作者的视线，并在各领域都有所涉及。然而MSCCM对于心肌细胞的保护作用还鲜有研究，本结果提示这些条件培养基可能在临床上具有潜在的治疗价值。由于MSC具有旺盛的分泌能力，目前已知的MSC分泌因子已达数十种。相信除抗氧化外，MSCCM还具有其它的功能，对其妥善的应用也许可以使MSC的用途更加广泛。

Figure 3.Protective effect of MSCCM on apoptotic rate of oxidatively injured H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs N group;＊＊P＜0.01 vs M group.图3 MSCCM对氧化损伤的H9c2细胞凋亡的影响

Figure 4.The effect of MSCCM on anti-oxidative signal pathway of H9c2 cells.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs 4 h group;＊＊P＜0.01 vs 8 h group;△△P＜0.01 vs 12 h group.图4 MSCCM对氧化损伤H9c2细胞抗氧化信号通路的影响

［参考文献］

［1］谭元生，谭超，邓圣明.中药防治心肌缺血/再灌注损伤分子机理研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2004，11(2) :174-178.

［2］Frangogiannis NG，Smith CW，Entman ML.The inflammatory response in myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2002，53(1) :31-47.

［3］Circu ML，Aw TY.Reactive oxygen species，cellular redox systems，and apoptosis［J］.Free Radic Biol Med，2010，48(6) :749-762.

［4］Dayan V，Yannarelli G，Billia F，et al.Mesenchymal stromal cells mediate a switch to alternatively activated monocytes/macrophages after acute myocardial infarction ［J］.Basic Res Cardiol，2011，106(6) :1299-1310.

［5］郑黎鹂，孙雯，解慧琪，等.载铜微泡促进间充质干细胞归巢至慢性心梗组织的研究［J］.中国病理生理杂志，2012，28(11) : 2087.

［6］Kupcova Skalnikova H.Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome［J］.Biochimie，2013，95(12) :2196-2211.

［7］莫世静，童秀珍，钟茜，等.骨髓间充质干细胞通过上调EPO表达减轻缺氧损伤引起的PC12细胞凋亡［J］.中国病理生理杂志，2013，29(1) : 62-69.

［8］Liu L，Cao JX，Sun B，et al.Mesenchymal stem cells inhibition of chronic ethanol-induced oxidative damage via upregulation of phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and modulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation in PC12 cells and neurons［J］.Neuroscience，2010，167(4) :1115-1124.

［9］Bozaykut P，Karademir B，Yazgan B，et al.Effects of vitamin E on peroxisome proliferator-activated receptor gamma and nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 in hypercholesterolemia-induced atherosclerosis［J］.Free Radic Biol Med，2014，70:174-181.

［10］Alfieri A，Srivastava S，Siow RC，et al.Targeting the Nrf2-Keap1 antioxidant defence pathway for neurovascular protection in stroke［J］.J Physiol，2011，589(Pt 17) : 4125-4136.

［11］Li W，Wu M，Tang L，et al.Novel curcumin analogue 14p protects against myocardial ischemia reperfusion injury through Nrf2-activating anti-oxidative activity［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2015，282(2) : 175-183.

［12］赵增光，刘应才.异鼠李素的心血管保护作用［J］.医学综述，2008，14(15) : 2321-2323.

［13］Mitra A，Ray A，Datta R，et al.Cardioprotective role of P38 MAPK during myocardial infarction via parallel activation of alpha-crystallin B and Nrf2［J］.J Cell Physiol，2014，229(9) :1272-1282.

［14］Xu B，Zhang J，Strom J，et al.Myocardial ischemic reperfusion induces de novo Nrf2 protein translation［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1842(9) : 1638-1647.

［15］Cai Q，Wei J，Zhao W，et al.Toxicity of Evodiae fructus on rat liver mitochondria: the role of oxidative stress and mitochondrial permeability transition［J］.Molecules，2014，19(12) : 21168-21182.

［16］Ide T，Tsutsui H，Hayashidani S，et al.Mitochondrial DNA damage and dysfunction associated with oxidative stress in failing hearts after myocardial infarction［J］.Circ Res，2001，88(5) :529-535.

［17］黄展勤，石刚刚.细胞凋亡与缺血性心脏病［J］.汕头大学医学院学报，2001，14(2) :148-150.

［18］Wang Y，Zhang H，Chai F，et al.The effects of escitalopram on myocardial apoptosis and the expression of Bax and Bcl-2 during myocardial ischemia/reperfusion in a model of rats with depression［J］.BMC Psychiatry，2014，14:349.

［19］Isele NB，Lee HS，Landshamer S，et al.Bone marrow stromal cells mediate protection through stimulation of PI3-K/Akt and MAPK signaling in neurons［J］.Neurochem Int，2007，50(1) :243-250.

［20］刘江月.梓醇对糖尿病大鼠主动脉的保护作用与抗氧化机制研究［J］.中国病理生理杂志，2014，30(6) : 1023-1028.

通讯作者△孙桂波Tel: 010-57833220; E-mail: sunguibo@126.com;孙晓波Tel: 010-57833013; E-mail: sun-xiaobo@163.com

*［基金项目］国家重大新药创制项目(No.2012ZX09501001004; No.2012ZX09301002-001)

［收稿日期］2015-02-09

［文章编号］1000-4718(2015)06-0961-06

［中图分类号］R363.2

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.001