一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法*

王文伟，祁小燕，张雪梅(复旦大学基础医学院生理与病理生理学系，上海000;复旦大学药学院药理学教研室，上海00;Research Center，Montreal Heart Institute，Montreal，Canada)



一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法*

王文伟1，祁小燕3，张雪梅2△
(1复旦大学基础医学院生理与病理生理学系，上海200032;2复旦大学药学院药理学教研室，上海201203;3Research Center，Montreal Heart Institute，Montreal，Canada)

［摘要］目的:探讨一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法。此方法使玻璃电极与细胞内液保持电化学连续性，使细胞内环境保持稳定，改善常规全细胞膜片钳破膜造成的破膜难和封接不稳，以及常规全细胞膜片钳破膜后造成的封接不稳。方法:以成骨细胞为研究对象，采用β-七叶素穿孔全细胞膜片钳技术，记录骨细胞L型钙通道电流。结果:采用这种穿孔全细胞膜片钳技术，能有效记录到成骨细胞上L型钙通道电流。结论:穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法，该方法的建立为今后更深入的研究疾病中成骨细胞的病理生理机制提供实验基础。

［关键词］骨细胞; L型钙通道电流;穿孔全细胞膜片钳;β-七叶素

［修回日期］2015-04-23

Perforated whole-cell patch recording of L-type calcium current with βescin in osteoblasts

WANG Wen-wei1，QI Xiao-yan3，ZHANG Xue-mei2
(1Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032;2Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai 201203，China;3Research Center，Montreal Heart Institute，Montreal，Canada.E-mail: xuemzhang@ shmu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To establish a perforated whole-cell patch-clamp technique with β-escin to record L-type calcium current (ICa，L) in osteoblasts.METHODS: ROS 17/2.8 is a rat osteoblast-like osteosarcoma cell line.β-escin was applied to the pipette solution to permeabilize the cell membrane and the perforated patch recording mode was obtained.RESULTS:β-escin at concentration of 50 μmol/L easily permeabilized the cell membrane and obtained a perforated patch recording mode in 2～7 min.This technique prevented ICa，Lrundown and preserved cytoplasmic signaling pathways.CONCLUSION:β-escin may be used as an alternative ionophore for perforated patch-clamp studies in osteoblasts and results in minimal rundown that could facilitate recordings of ICa，Lin osteoblasts.

［KEY WORDS］Osteoblasts; L-type calcium current; Perforated whole-cell patch-clamp;β-escin

L型钙通道存在于骨细胞包括成骨细胞［1］和破骨细胞［2］中，激活该通道可以增加骨密度［1］，降低骨吸收［3］，调节机械力诱导的骨形成［4］，调节甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)和活性维生素D3对骨钙平衡的作用［5］，在骨重建和骨质疏松等骨疾病中起重要调节作用［6］。膜片钳是研究L-型钙通道特性的最主要方法。常规的全细胞膜片钳方法必须在电极尖端施加负压以吸破细胞膜，造成电极内液与细胞内液相通，细胞内容物被电极内液稀释，甚至被吸到电极内而导致细胞内容物丢失，尤其那些维持离子通道活性和信号转导物质和能量物质如ATP的丢失将严重影响细胞功能，L型钙通道电流(ICa，L)随记录时间逐渐减弱的现象(rundown)就是这种记录方法的缺陷所造成的典型后果［7］。穿孔膜片钳技术是用具有膜穿孔能力的物质多烯抗生素，这种物质可以在细胞的脂质双层结构上形成孔道，使电极内液通过这些孔道与细胞内液在电学上相通，且不影响细胞内物质的浓度，保持细胞功能的一种膜片钳方法。穿孔全细胞膜片钳有效地避免了细胞内物质的流失，胞质渗漏极为缓慢，可以进行长时间稳定的记录;同时还具有对细胞损伤小的优点。我们实验中用的成骨细胞ROS 17/2.8，细胞膜比较厚，很难用负压吸破，用负压破膜成功率仅1%。我们用β-七叶素(β-escin)在成骨细胞膜上穿孔，细胞破膜率可以提高至90%，且可以预防记录过程中ICa，L的衰减现象。

材料和方法

1溶液配制

1.1电极内液100 mmol/L KOH，150 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，2 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L K2HPO4(pH 7.4)。

1.2含β-escin的电极内液β-escin储存液(25 mmol/L)配法:将0.0275 g β-escin粉末溶解于1 mL双蒸水中，分装，放在棕色瓶中避光保存，可在－20℃保存2周。实验当天解冻后，将1～2 μL储存液加入0.5 mL电极内液中(在1.5 mL Eppendorf管中进行)，然后漩涡混匀大约1 min。Escin在电极内液中的终浓度为50 μmol/L，因为escin对光敏感，因此Eppendorf管应该用铝箔包裹。

1.3细胞外液140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，20 mmol/L HEPES(pH 7.4)。一旦全细胞封接形成，115 mmol/L BaCl2和20 mmol/L HEPES (pH 7.4)加入上述浴液中，使浴液中Ba2+的终浓度为20 mmol/L，钾电流则被四乙胺阻断。

2全细胞穿孔破膜记录

在没有正压的情况下，将电极接近细胞表面，在接触到细胞膜时，负压吸引，形成高阻封接，然后放开负压。连续施加超极化脉冲(－60 mV～－65 mV，10 ms)，持续观察，1～3 min后β-escin对细胞膜进行穿孔，如果电容电流增加，表明孔道逐渐形成，电极内液与细胞内液相通，约5 min内可以获得低细胞膜串联电阻的穿孔膜片，待电容电流不再增加，便形成稳定的穿孔膜片钳记录模式。

电极内液充灌:玻璃电极(无芯玻璃电极)在拉制机(PC-10，Narishige)上两步拉制而成，充灌电极液后，尖端阻抗为2～3 MΩ。拉制好的电极先在不含β-escin的电极液中浸约30 s，然后从电极尾部反向充灌含β-escin的电极内液，用手指轻弹电极中部排除尖端气泡。电极尖端越长，无β-escin电极液的深度越深，则β-escin扩散到电极口处的时间越长，破膜时间也越长，理想的深度是在高阻封接形成数1～2 min β-escin扩散到电极口处。含β-escin电极内液在充灌前要振摇电极內液充灌注射器，使β-escin分子尽量均匀分布。含β-escin电极內液一般使用4～5 h，之后破膜效率会降低，建议4～5 h后更换新鲜的电极內液。

结果

在室温下，运用β-escin穿孔膜片钳方法能成功记录到骨细胞L型钙通道电流，刺激方案和结果见图1，随着电压的增加，电流逐渐增大，I-V曲线显示刺激电压在30 mV左右时电流最大(图2)。整个记录过程中无明显衰减现象。

Figure 1.Original recording of L-type calcium currents in osteoblasts.图1骨细胞膜L型钙通道电流曲线

讨论

穿孔全细胞膜片钳法特点是不打破电极腔下的细胞膜片，而利用具有膜穿孔能力的物质在细胞膜上形成高离子通透的小孔来构成通电性回路。与全细胞记录模式相比，穿孔全细胞记录模式对细胞损伤小，记录持续时间长。因为不需要打破细胞膜，防止了因负压吸引或电击破膜可能对封接产生的破坏，因此封接不容易丧失。

目前常用于膜片钳技术的膜穿孔物质有制霉菌素和两性霉素B［8］，均难溶于水，充灌不当这2种物质在电极尖端开口处常残存没有溶解的颗粒，从而影响高阻封接质量，导致封接成功率降低。两性霉素B在细胞膜上形成的孔道较小(4～8 nm)，仅一价离子可以有效通过，其缺点是Mg2+、Ca2+等多价离子均不能通过细胞膜［9］，所以本实验不用来记录钙电流。β-escin在细胞膜上形成的孔道较两性霉素B大，Ca2+能有效通过，因此能进行Ca2+电流的记录。在Ca2+激活钾通道电流SK2的研究中，可以将两性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳记录［9］。

我们实验记录成骨细胞ROS 17/2.8的L-型钙通道电流，用β-escin作穿孔物质［10］对膜的通透性具浓度依赖性［11］，其破膜难易程度与不同种类细胞膜的结构特性有密切关系。王华等［9］的实验中用心房肌细胞，高浓度β-escin孔道形成早，会影响封接而不能形成有效的记录模式。在骨骼肌细胞，推荐浓度为20～50 μmol/L β-escin［10］。我们实验中所用的ROS 17/2.8成骨细胞比心肌、平滑肌和骨骼肌更不易破膜，20 μmol/L时的破膜成功率仅约10～20%，35 μmol/L成功率约50%，当提高到50 μmol/L时成功率可达到90%，而且记录稳定持续1～2 h，无明显衰减现象［12］。该方法的建立为今后更深入地研究疾病中骨细胞的病理生理机制提供了一种可靠而有效的实验方法。

［参考文献］

［1］Guggino SE，Lajeunesse D，Wagner JA，et al.Bone remodeling signaled by a dihydropyridine- and phenylalkylamine-sensitive calcium channel［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86(8) : 2957-2960.

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［3］Ritchie CK，Maecklein PB，Fitzpatrick LA.Direct effect of calcium channel antagonists on osteoclast function: alterations in bone resorption and intracellular calcium concentrations［J］.Endocrinol，1994，135(3) :996-1003.

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［5］Li J，Duncan RL，Burr DB，et al.Parathyroid hormone enhances mechanically induced bone formation，possibly involving L-type voltage-sensitive calcium channels［J］.Endocrinol，2003，144(4) :1226-1233.

［6］王连唐，刘子君，郑铭豪.骨破骨细胞生物学研究的一些进展［J］.中国病理生理杂志，1997，13(6) : 746-750.

［7］Horn R，Korn SJ.Prevention of rundown in electrophysiological recording［J］.Methods Enzymol，1992，207: 149-155.

［8］Akaike N，Harata N.Nystatin perforated patch recording and its applications to analyses of intracellular mechanisms ［J］.JPN J Physiol，1994，44(5) :433-473.

［9］王华，李涛，雷明，等.二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用［J］.中国应用生理学杂志，2012，28(3) :214-218.

［10］Fan JS，Palade P.Perforated patch recording with beta-escin［J］.Pflugers Arch，1998，436(6) :1021-1023.

［11］Fu LY，Wang F，Chen XS，et al.Perforated patch recording of L-type calcium current with beta-escin in guinea pig ventricular myocytes［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24(11) :1094-1098.

［12］Li F，Wang W，Gu M，et al.L-type calcium channel activity in osteoblast cells is regulated by the actin cytoskeleton independent of protein trafficking［J］.J Bone Miner Metab，2011，29(5) :515-525.

通讯作者△Tel: 021-51980046; E-mail: xuemzhang@ shmu.edu.cn

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81370979)

［收稿日期］2015-01-30

［文章编号］1000-4718(2015)06-1150-03

［中图分类号］R33-33; R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.033