抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤*

张　军，代文静，周敬群△，张家俊，曹志刚(三峡大学仁和医院ICU科，心血管内科，湖北宜昌443000)



抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤*

张军1，代文静2，周敬群2△，张家俊1，曹志刚1
(三峡大学仁和医院1ICU科，2心血管内科，湖北宜昌443000)

［摘要］目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型，并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L) Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化，利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率; real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况; Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比，H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降，细胞凋亡率显著升高(P＜0.05) ; LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P＜0.05) ; GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P＜0.05) ; CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P＜0.05)。与H/R模型组相比，抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后，心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高，细胞凋亡率逐渐降低(P＜0.05)，LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P＜0.05)，GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P＜0.05)，CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低，而Akt磷酸化水平显著增加(P＜0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率，抑制细胞凋亡，通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用，并与激活Akt磷酸化有关。

［关键词］Klotho蛋白;缺氧/复氧;氧化应激;内质网应激;细胞凋亡

Anti-aging Klotho protein reduce the hypoxia/reoxygenation injury of neonatal rat myocardial cells

ZHANG Jun1，DAI Wen-jing2，ZHOU Jing-qun2，ZHANG Jia-jun1，CAO Zhi-gang1
(1Department of ICU，2Department of Cardiology，Renhe Hospital，Three Gorges University，Yichang 443000，China.E-mail: zhoujingqun-1@ medmail.com.cn)

［ABSTRACT］AIM: To study the effects of anti-aging Klotho protein on neonatal rat myocardial cells with hypoxia/reoxygenation (H/R) injury.METHODS: The cardiomyocytes of neonatal SD rats were cultured to establish hypoxia/reoxygenation model.The myocardial cells were divided into normal control group，H/R model group，different concentrations of Klotho protein (0.1 μmol/L，1 μmol/L and 10 μmol/L) pretreatment groups.The myocardial cells pulse frequency was observed before and after H/R.The cell viability was measured by MTT assay.The leakages of LDH，CK and AST，the content of MDA and the activity of SOD were detected.The apoptotic rate of the myocardial cells was analyzed by flow cytometry.The mRNA expression of endoplasmic reticulum stress markers and apoptosis-related molecules GRP78，CRT，CHOP and caspase-12 was measured by real-time PCR.The protein levels of CHOP，caspase-12 and phosphorylated Akt in the myocardial cells were determined by Western blot.RESULTS: Compared with normal control group，the pulse frequency，cell viability rate and SOD activity of myocardial cells were significantly decreased，the cell apoptotic rate as well as the contents of LDH，CK，AST and MDA were increased in H/R model group.The mRNA expressions of GRP78，CRT，CHOP and caspase-12 as well as the protein levels of CHOP and caspase-12 were increased，whereas p-Akt level was decreased obviously.Compared with H/R model group，the pulse frequency，cell viability rate and SOD activity were increased significantly，the cell apoptotic rate as well as the contents of LDH，CK，AST and MDA were decreased in Klotho pretreated group.The mRNA expression of GRP78，CRT，CHOP and caspase-12 as well as the protein levels of CHOP andcaspase-12 were decreased，while p-Akt level increased significantly.CONCLUSION: Anti-aging Klotho protein improves the myocardial cell survival and inhibits the apoptosis by increasing the resistance of the cells to oxidative stress and excessive endoplasmic reticulum stress response，which is related with the activation of Akt phosphorylation in H/R-injured mycardial cells.

［KEY WORDS］Klotho protein; Hypoxia/reoxygenation; Oxidative stress; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是指心肌组织缺血一段时间后再恢复血流，却使心肌细胞损伤加重进而影响心肌功能、发生代谢障碍和心肌超微结构改变，使缺血更为严重和心脏功能恶化的损伤综合征［1］。I/R发生机制复杂，对缺血性心脏病治疗影响较大，因此对I/R损伤病理原因的研究和寻求有效的保护药物成为目前关注的热点。前期研究表明I/R触发的细胞氧化应激刺激和过度内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)都会导致心肌细胞功能障碍和细胞凋亡［2］。心肌缺血损伤是因为心肌缺氧、缺营养成分造成心肌细胞坏死或暂时性功能受损，因此体外培养原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤模型是目前主要模拟心肌缺血再灌注的模型之一［3］。抗衰老Klotho蛋白是一种与机体衰老相关的重要蛋白，可以发挥抑制机体衰老、抗氧化、抗凋亡作用，对心血管、肾等多种器官损伤有抑制作用［4］。心肌缺血疾病多发于老年人群体，老年人群体心血管疾病术后I/R损伤的概率更大，但目前针对抗衰老因素对I/R损伤相关性的研究较少见。因此，本研究以SD大鼠乳鼠原代心肌细胞为研究对象并建立H/R损伤模型，观察抗衰老Klotho蛋白对心肌细胞H/R损伤的影响，从抗氧化应激和内质网应激方面探讨其作用机制，并揭示其与Akt信号通路的关系。

材料和方法

1实验动物和试剂

清洁级SD 1 d内大鼠乳鼠由武汉大学基础医学院实验动物中心提供; Klotho蛋白购自R＆D; DMEM细胞培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco;二苯基溴化四氮唑(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma;肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所; Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒购自北京鼎国生物公司; RNAiso Plus Reagent试剂盒、Prime ScriptTMRT Reagent反转录试剂盒、SYBRPremix ExTaqTM实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa; CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP )、 caspase-12、Akt和p-Akt抗体购自Abcam; HRP标记山羊抗兔IgGⅡ抗和ECL化学发光试剂购自北京中杉金桥公司;其它试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1大鼠乳鼠心肌细胞的原代培养在无菌条件下解剖取出出生24 h内SD大鼠乳鼠的心脏组织，用灭菌PBS清洗1遍后，用小剪刀反复剪碎心脏组织，采用含胰酶和Ⅱ型胶原酶的混合消化液在37℃进行消化。将消化好的细胞悬液过200目细胞筛，1 500 r/min离心10 min，弃去上清，用含15%胎牛血清及双抗(青霉素+链霉素)的DMEM细胞培养基重悬细胞，在37℃、5% CO2培养箱中差速培养1 h后收集未贴壁的细胞以除去成纤维细胞。调节细胞浓度以5×108/L分别接种于96孔板和6孔细胞培养板中，24 h后换液继续培养。等细胞基本融合成片后，取生长状态良好且同步搏动的细胞用于实验。

2.2心肌细胞缺氧/复氧模型的建立及实验分组用纯氮N2以1 L/min流速充分饱和不含胎牛血清的DMEM培养基30 min后换液并置于缺氧箱中，同样以1 L/min流速通入含95% N2和5% CO2的混合气体缺氧培养4 h后更换正常培养基放回正常含95% O2和5% CO2培养箱中复氧培养12 h，构建乳鼠原代心肌细胞H/R模型。同时将原代心肌细胞分为以下组: (1)正常对照组(control)，即用含15%胎牛血清DMEM培养至实验结束; (2) H/R组，即缺氧4 h后复氧培养12 h; (3)不同浓度Klotho+ H/R组，即先将分离心肌细胞置于含不同浓度(0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L)的Klotho蛋白培养基中正常培养24 h后，重复H/R组操作步骤。

2.3 MTT检测细胞存活率取生长状态良好的乳鼠原代心肌细胞接种于96孔板中，并按照上述分组分别处理各组细胞，选取缺氧前和复氧后1 h两个时点在显微镜下摄像记录各组心肌细胞缺氧前和复氧后搏动频率。培养结束后，在每组各孔中加入20 μL 的MTT溶液(5 mg/L)，在37℃下继续正常培养4 h后，弃去上清，每孔加入150 μL的DMSO，在摇床上作用10 min等结晶完全溶解后，在酶标仪上检测590 nm处各孔的吸光度值(A)，每组设置6个复孔。各组心肌细胞存活率(%)=处理组A590/正常组A590×100%。

2.4 LDH、CK、AST、MDA及SOD的测定各组心肌细胞经分组处理后，继续培养24 h，收集各组细胞的上清液。按照检测试剂盒的说明书步骤，分别检测各组细胞上清液中CK、LDH和AST的分泌量。同时收集各组处理完毕的心肌细胞，RIPA强裂解液提取细胞中总蛋白后测定心肌细胞内MDA含量、SOD活性变化。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡率各组心肌细胞分组培养结束后，用含0.25%的胰酶消化离心收集各组细胞，用PBS洗涤1遍后重悬细胞调节浓度为109/L，各组取200 μL细胞悬液。按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒操作，先各加入5 μL FITC标记的Annexin V和5 μL PI混匀避光室温孵育20 min，PBS洗涤1次后离心，并用150 μL PBS重悬细胞。运用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率变化。

2.6 Real-time PCR检测内质网应激分子mRNA表达根据GenBank中公布大鼠葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)、钙网蛋白(calreticulin，CRT)、CHOP、caspase-12和β-actin的cDNA序列设计实时荧光定量PCR的特异性引物(表1)，并由Invitrogen合成。采用相同的方法分组处理乳鼠心肌细胞，后消化离心收集各组细胞。利用TaKaRa RNAiso Plus Reagent试剂盒提取各组细胞中总RNA，并逆转录得到cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。利用Bio-Rad公司的IQ5TMreal-time PCR系统检测各组心肌细胞内GRP78、CRT、CHOP、caspase-12 mRNA表达，并根据2－ΔΔCt方法对各基因mRNA表达量进行相对定量。

表1　 Real-time PCR引物序列Table 1.The primer sequences of real-time PCR

2.7 Western blot检测CHOP、caspase-12、Akt及p-Akt蛋白表达离心收集各组处理好的心肌细胞，PBS洗涤1次后利用RIPA强裂解液提取细胞中总蛋白，BCA方法测定各组细胞中提取总蛋白的浓度。每组上样30 μg总蛋白进行12%的SDS-PAGE 1.5 h，转PVDF膜，用5% BSA封闭30 min后分别孵育CHOP、caspase-12、Akt、p-Akt及内参照β-actin I抗(1∶1 000) 4℃过夜，TBST洗涤3次后再分别孵育HRP标记山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000) 2 h，TBST洗涤3次后，ECL化学发光显影，曝光并拍照，利用Quantity One软件分析各目的蛋白的相对表达量。

3统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析。所有数据用均值±标准差(mean±SD)表示，数据进行方差齐性检验，方差齐者多组间数据比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Klotho蛋白对H/R前后心肌细胞搏动频率和存活率的影响

H/R模型组中乳鼠原代心肌细胞复氧后的搏动频率显著低于缺氧前(P＜0.05) ;而0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白同时作用组中原代心肌细胞复氧后搏动频率同样均低于缺氧前状态，但显著高于H/R模型组且具有浓度效应(P＜0.05)。同时MTT检测心肌细胞存活率结果显示，与正常对照组相比，H/R模型组中乳鼠原代心肌细胞存活率显著降低(P＜0.05)。当0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白同时作用于心肌细胞，H/R后细胞的存活率逐渐上升，与单独H/R模型组相比有显著差异(P＜0.05)，见表2。

表2　 Klotho蛋白对H/R前后心肌细胞搏动频率和存活率的影响Table 2.The effect of Klotho protein on the pulse frequency and survival rate of myocardial before and after H/R (Mean ±SD.n=5)

2 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞LDH、CK和AST漏出量的影响

与正常对照组相比，H/R模型组培养的心肌细胞中LDH、CK和AST的漏出含量均显著增多(P＜0.05)，说明H/R后心肌细胞受到明显损伤。而与H/R模型组相比，0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白作用组心肌细胞H/R损伤后LDH、CK和AST的漏出含量均明显减少(P＜0.05)，并具有一定的浓度效应，说明抗衰老Klotho蛋白作用可降低心肌细胞H/R损伤，见表3。

表3　 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞LDH、CK和AST漏出量，MDA含量及SOD活性的影响Table 3.The effect of Klotho protein on the leakages of LDH，CK and AST，the content of MDA and SOD activity in myocardial cells after H/R (Mean±SD.n=5)

3 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞MDA含量和SOD活性的影响

与正常对照组相比，H/R模型组心肌细胞中MDA含量显著升高，而SOD活性显著降低(P＜0.05)，说明心肌细胞H/R后抗氧化能力下降。而当0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白作用后，H/R后原代心肌细胞中MDA含量逐渐降低，SOD活性则逐渐显著上升，具有一定浓度效应，且与H/R模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

4 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞凋亡的影响

流式细胞术检测发现，乳鼠原代心肌细胞H/R后细胞大量凋亡，而抗衰老Klotho蛋白作用能够降低H/R后细胞凋亡率，见图1。经统计发现，与正常对照组相比，H/R模型组心肌细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。而经过不同浓度0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白作用，各组心肌细胞H/R后细胞凋亡率逐渐下降，与H/R模型组相比差异有统计学意义。

Figure 1.The effect of Klotho protein on the apoptotic rate of myocardial cells after H/R.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs H/R.图1 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞凋亡的影响

5 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞内质网应激分子mRNA表达的影响

Real-time PCR可以检测抗衰老Klotho蛋白对乳鼠原代心肌细胞H/R损伤后内质网应激相关分子GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达的影响，结果见图2。与正常对照组相比，H/R模型损伤组心肌细胞中内质网应激反应标记分子GRP78和CRT的mRNA表达均显著上升(P＜0.05)，而其内质网应激反应凋亡相关蛋白CHOP和caspase-12 mRNA表达也显著升高(P＜0.05)，说明心肌细胞H/R损伤诱导内质网应激相关基因的表达。当不同浓度Klotho蛋白作用心肌细胞后，内质网应激反应相关分子GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达均显著降低并具有明显浓度效应，与单独H/R模型损伤组相比差异有统计学意义。

Figure 2.The effect of Klotho protein on the mRNA expression of endoplasmic reticulum stress related genes in the myocardial cells after H/R by real-time PCR.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs H/R.图2 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞内质网应激相关基因表达的影响

6 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞CHOP、caspase-12、Akt及p-Akt蛋白表达的影响

Western blot检测发现乳鼠原代心肌细胞H/R损伤后内质网应激诱导凋亡蛋白CHOP和caspase-12表达明显增加，而抗衰老Klotho蛋白预作用心肌细胞后，CHOP和caspase-12蛋白表达逐渐降低，见图3。与正常对照组相比，H/R模型组中CHOP和caspase-12蛋白表达均显著升高(P＜0.05) ;而不同浓度(0.1、1、10 μmol/L)抗衰老Klotho蛋白作用，各组心肌细胞H/R后，内质网应激诱导凋亡蛋白CHOP和caspase-12表达显著下降，与H/R模型组相比差异有统计学意义。同时对各组间Akt和p-Akt蛋白水平的检测发现，心肌细胞H/R损伤降低p-Akt的水平，而抗衰老Klotho蛋白作用可以增加心肌细胞H/R损伤后p-Akt的水平，见图4。

讨论

随着临床上越多地开展经皮冠状动脉介入治疗术、体内外循环手术，心肌组织缺血/再灌注引起的病理损伤问题亦受到更多的关注［5］。尽管医疗水平已显著上升，心肌缺血再灌注引起的心肌细胞坏死和凋亡仍导致较高的术后死亡率［6］。有研究表明缺血再灌注导致的细胞内抗氧化系统损伤和内质网应激介导是心肌细胞凋亡的主要诱因［7］。因为老年人群体患心血管疾病的概率较大，冠状动脉硬化导致心肌梗死及术后缺血再灌注损伤多见于老年患者，提示I/R损伤程度及概率与衰老因素有关［8］。有研究表明抗衰老Klotho基因在人和小鼠中可通过选择性剪切拼接产生2种Klotho蛋白产物，一种为膜型Klotho蛋白，主要在肾脏、胎盘、小肠及前列腺中表达;另一种为分泌型Klotho蛋白，以游离形式发挥作用，在人的多种组织及血清中均能检测到存在，而分泌型Klotho蛋白现在已被认为是一种抗衰老调节激素，对多种靶器官发挥重要生理调节效应，并能够保护心血管系统，对衰老相关性疾病进行调节［9］。最近研究表明，Klotho蛋白与人类心血管疾病、肾等器官损伤修复都有密不可分的关系，但关于其能否在心肌缺血再灌注损伤修复中发挥作用尚未见研究［10］。本文中构建乳鼠原代心肌细胞H/R损伤模型模拟心肌缺血再灌注，研究发现抗衰老Klotho蛋白作用心肌细胞H/R损伤后搏动频率和细胞存活率均显著增加，明显高于H/R损伤组并具有浓度效应，说明抗衰老Klotho蛋白能够减轻心肌细胞H/R后损伤。

Figure 3.The effect of Klotho protein on the expression of CHOP，caspase-12 protein in myocardial cells after H/R.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs H/R.图3 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞CHOP、caspase-12蛋白表达的影响

Figure 4.The effect of Klotho protein on the protein level of p-Akt in myocardial cells after H/R.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs H/R.图4 Klotho蛋白对H/R后心肌细胞p-Akt水平的影响

目前有研究认为心肌I/R损伤与细胞中氧自由基大量产生，抗氧化应激系统受损有关，氧自由基的产生，可使心肌细胞中过氧化物增多，MDA含量增加，进而导致细胞膜结构和功能的改变，使心肌细胞受损而凋亡［11］。心肌细胞缺氧时，代谢功能发生障碍且细胞膜受损，当复氧培养后会产生大量氧自由基，使细胞膜脂质过氧化损伤［12］。MDA是机体脂质过氧化损伤的敏感指标，其含量多少可间接反映机体细胞受自由基氧化损伤程度［13］。SOD作为一种抗氧化酶，可以抵抗机体受氧化损伤，其活性高低也可反映机体抗体抗氧化能力［14］。本研究中乳鼠原代心肌细胞H/R损伤后MDA含量显著上升而SOD活性显著下降，说明心肌细胞H/R损伤后，细胞内抗氧化系统也受到影响而抗氧化能力严重下降。当不同浓度抗衰老Klotho蛋白预作用于心肌细胞，H/R损伤后细胞中MDA含量逐渐下降，而SOD活性逐渐上升，说明Klotho蛋白能够刺激心肌细胞的抗氧化抵抗系统，增强细胞对氧自由基的清除以减轻H/R损伤，从而对受H/R损伤的心肌细胞发挥保护作用。而心肌细胞中CK、LDH及AST漏出量也可作为心肌细胞损伤的指标，LDH、CK和AST都是心肌细胞的胞内酶，其漏出量多少能直接反映细胞功能变化和细胞膜的受损程度［15］。本研究中原代心肌细胞H/R损伤后发现LDH、CK及AST漏出量均显著增加，说明H/R能严重损伤心肌细胞结构完整性和功能。当不同浓度抗衰老Klotho蛋白预作用H/R损伤心肌细胞后，LDH、CK和AST漏出量均显著降低，远低于单独H/R模型组，说明Klotho蛋白能维持H/R损伤后心肌细胞的膜结构和功能。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指当细胞处于内外不利因素时，内质网稳态被破坏，导致发生大量错误或未折叠蛋白在内质网中聚集，激活相应信号通路引起细胞内一系列反应，其参与细胞凋亡过程，与各种病理生理反应如心肌缺血再灌注损伤、毒理、病理反应均有关［16］。而内质网对活性氧自由基应激因素非常敏感，心肌细胞大量活性氧自由基产生时可直接导取内质网功能障碍，激发ERS反应，因此ERS反应参与到心肌细胞I/R损伤的病理过程中［17］。ERS是细胞内的自我保护机制之一，但过度的内质网应激会损伤细胞内质网功能从而激活细胞凋亡通路使细胞发生凋亡［18］。GRP78和CRT都是内质网关键分子伴侣，在ERS激活过程中发挥重要作用，其表达上调标志ERS的激活［19］。Millott等［20］研究也发现心肌缺血再灌注能够激活ERS中GRT78和CRT表达增加。本研究中利用real-time PCR检测原代心肌细胞H/R后同样发现GRT78和CRT的mRNA表达显著上升，说明H/R损伤与大量ERS反应有关。而当抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后，GRT78和CRT的mRNA表达虽然仍高于正常对照组，但已逐渐低于H/R模型组，说明Klotho蛋白能够减轻心肌细胞内ERS反应，维持内质网稳态。

内质网应激诱发的细胞凋亡与CHOP和caspase-12有关，CHOP表达激活转录和内质网所特有半胱氨酸蛋白酶caspase-12的激活都能启动细胞凋亡程序［21］。CHOP是转录因子家族C/EBP成员，在正常生理状况下表达极低，而当内质网发生应激反应时其表达显著被诱导并参与下游细胞凋亡相关基因表达［22］。Caspase-12是内质网膜上的组成蛋白，在内质网应激时能经过特定位点的剪切激活诱发细胞凋亡，因此，caspase-12是内质网凋亡信号通路的关键分子［23］。本研究中流式细胞术检测发现H/R后心肌细胞发生凋亡，而凋亡率显著上升，同时利用real-time PCR检测发现原代心肌细胞H/R后CHOP和caspase-12 mRNA表达均显著升高，而Western blot检测也发现正常心肌细胞中CHOP和 caspase-12蛋白表达较低，而H/R后CHOP和caspase-12蛋白表达却显著上升与其mRNA表达具有一致性，再次说明心肌细胞H/R损伤激活CHOP 和caspase-12引起细胞凋亡。当不同浓度抗衰老Klotho蛋白作用心肌细胞H/R后，细胞凋亡率却均显著下降，而CHOP、caspase-12 mRNA和蛋白表达随之逐渐降低，说明Klotho蛋白通过降低CHOP和caspase-12表达，抑制H/R诱发的内质网应激。Akt信号途径在细胞生长、增殖、凋亡等生理活动中发挥重要作用，当Akt磷酸化后被激活并参与细胞迁移、侵袭、促进血管修复和生成并抑制细胞凋亡过程［24］。前期研究表明Akt磷酸化增加能够抑制心肌细胞的凋亡，发挥心肌保护作用，对缺血性心脏疾病治疗具有重要作用［25］。而有研究报道，抗衰老蛋白Klotho发挥抗氧化作用，并参与心血管等组织的损伤修复与Akt信号途径活化有关［26］。本研究利用Western blot检测心肌细胞H/R前后Akt和p-Akt水平的变化，发现心肌细胞H/R前后Akt总量无明显变化，但p-Akt水平显著下降，说明H/R损伤引起的心肌细胞凋亡与Akt磷酸化水平降低有关。当高浓度Klotho蛋白作用于心肌细胞，H/R损伤后细胞中p-Akt/Akt比值显著增加，说明Klotho蛋白能够刺激心肌细胞中Akt磷酸化水平，抑制H/R损伤造成的细胞凋亡从而发挥细胞保护作用。而另有研究表明，FGF信号通路可通过低血压效应减少缺血、缺氧再灌注对组织的损伤，Klotho蛋白可以作为辅助因子与FGF23受体(FGF23 receptor，FGFR)结合，增强FGFR和FGF23的亲和力，通过FGF23/Klotho-FGFR途径发挥生物学效应［27］。因此，抗衰老Klotho蛋白保护H/R损伤后的心肌细胞具体的分子机制有必要进行进一步研究。

综上所述，抗衰老Klotho蛋白能够提升心肌细胞H/R损伤后的细胞存活率，抑制细胞凋亡，通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥保护作用，并与激活Akt磷酸化有关。

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［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.004

通讯作者△Tel: 0717-6555730; E-mail: zhoujingqun-1@ medmail.com.cn

*［基金项目］湖北省教育厅自然科学研究计划重点项目(No.D20091308)

［收稿日期］2014-12-25
［修回日期］2015-01-12

［文章编号］1000-4718(2015)06-0980-08