不同品种皱皮木瓜过氧化物酶特性的比较研究

宋双双,王 晓,杜金华,刘 峰,Dan Staerk,耿岩玲,崔 莉,*

(1.山东省分析测试中心,山东济南 250014;2.山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安 271018)



不同品种皱皮木瓜过氧化物酶特性的比较研究

宋双双1,2,王 晓1,杜金华2,刘 峰1,Dan Staerk1,耿岩玲1,崔 莉1,*

(1.山东省分析测试中心,山东济南 250014;2.山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安 271018)

以不同品种的皱皮木瓜为原料,用Tris-HCl缓冲液提取过氧化物酶(POD),以愈创木酚-H2O2为底物,采用比色法对3个品种的皱皮木瓜POD酶学性质进行了比较研究。结果显示,品种YATS 066(A)、YATS153(B)、YATS251(C)的POD最适温度分别为20、25、30℃,都在20℃以内能较好的保持活性。三个品种的POD都有两个最适pH,pH稳定性范围分别在7.5～9、3～6、3.5～7。金属离子对A、B的影响基本相同。对三个品种的抑制能力最强的抑制剂是SDS,其次为抗坏血酸。

皱皮木瓜,过氧化物酶,酶学特性

皱皮木瓜又名汤木瓜、宣木瓜等,是蔷薇科贴梗海棠[Chaenomelesspiciosa(Sweet)Nakai]的近成熟果实,主要产于安徽、浙江、湖北、四川等地[1],具有舒筋活络,和胃化湿的功效[2]。由于含有多种氧化相关酶类,木瓜在生产加工过程中易发生褐变,严重的影响产品的感官品质和食用价值。目前,皱皮木瓜的研究主要集中在化学成分、功能活性成分[3-5]以及挥发性成分[6]等方面,抗氧化相关酶类方面,相关报道主要有SOD酶的分离纯化[7]、多酚氧化酶(PPO)的性质研究[8]等,对于过氧化物酶(POD),仅见番木瓜中POD的纯化及性质研究[9],关于皱皮木瓜中POD的酶学特性的研究尚未见报道。

POD广泛存在于动植物和微生物体内,是一种以血红素为辅基的氧化酶[10],可催化由过氧化氢参与氧化各种还原剂的反应[11],是果实成熟和衰老的生理指标,催化酚类物质、谷胱甘肽、抗坏血酸的氧化,从而参与果实酶促褐变,对果实的色泽及成分含量等造成不良影响,降低产品品质,因而在果实加工中需要对过氧化物酶进行防治,抑制或降低其酶活[12]。目前,对POD的纯化及酶学性质研究较广泛,但是对于大部分原料,其不同品种间的POD酶学性质的比较研究还较少。

本文通过研究不同品种的皱皮木瓜中POD的酶学性质,比较不同品种皱皮木瓜的POD的酶学特性差异,为进一步深入的研究POD的分子结构,进而指导生产,提高皱皮木瓜加工产品的品质等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

不同品种皱皮木瓜由山东亚特生态技术有限公司提供,-20℃贮藏,品种及编号见表1。

表1 不同品种皱皮木瓜的编号Table1 The serial number of different cultivars of Chaenomeles

Tris、谷胱甘肽(还原型) Klontech公司,分析纯;浓盐酸、愈创木酚、30% H2O2、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、硫酸钠、氯化钙、六水氯化镁、七水硫酸锌、四水氯化锰、氯化钾、抗坏血酸、亚硫酸钠、DTT、Kojic acid、吐温-80、SDS、EDTA-2Na、Tropolone 国药集团化学试剂有限公司,分析纯;石英砂、偏重亚硫酸钠 天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯;柠檬酸、柠檬酸钠 天津市光复科技发展有限公司,分析纯。

GENESYS 10S UV-VIS紫外可见分光光度计 Thermo公司;HH-S2数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;Thermo Multifuge X1R离心机 Thermo公司;人工气候箱 宁波莱福科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液的提取 取不同品种的皱皮木瓜果肉各10.00g,以1∶1.5料液比(20mmol/L Tris-HCl缓冲液 pH7.5)低温下研磨,研磨液4℃ 10000r/min离心20min,上清液即为所需粗酶液,于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 POD活性的测定 测定溶液体系为pH7.5、20mmol/L Tris-HCl缓冲液3mL,其中2.95mL底物含有10mmol/L愈创木酚和10mmol/L H2O2,0.05mL酶液。于25℃条件下测定反应20min在470nm的吸光度变化值。以每分钟每毫升反应体系OD值改变0.01为一个酶活力单位(U)[13]。

1.2.3 酶学性质的测定

1.2.3.1 最适温度和温度稳定性 将底物分别置于4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55℃的水浴锅中保温5min,加入不同品种皱皮木瓜的粗酶液,反应20min,于470nm下测定吸光度。以最适温度的酶活性为100%,其余温度下测定的酶活性与之的比值即为相对酶活性[5]。

不同品种皱皮木瓜的粗酶液分别保存于10、20、30、40℃,待20、40、60min取出于25℃反应20min,470nm测定酶活性[14]。以每个温度下的初始酶活性为100%,不同时间测定的酶活性与之相比即为相对酶活性。

1.2.3.2 最适pH和pH稳定性 测定不同品种皱皮木瓜的粗酶液在不同pH(pH3～5,柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH5.5～7.5,磷酸一氢钠-磷酸二氢钠缓冲液;pH8～9,Tris-Hcl缓冲液)时的酶活性[15],每间隔0.5测酶活性。以最适条件下的酶活性为100%,其余pH条件下测定的酶活性与之的比值即为相对酶活性。

将不同品种皱皮木瓜的粗酶液分别在不同pH的缓冲液中4℃保存6h,于25℃反应20min,470nm测定酶活性。以最适条件下的酶活性为100%。

1.2.3.3 金属离子的影响 分别配成终浓度为含有1、5、10mmol/L金属离子的底物溶液,25℃条件下反应20min,测定酶活力,以不含金属离子时的酶活力为100%,分析不同的金属离子对POD酶活性的影响。

图1 不同品种皱皮木瓜POD的最适温度Fig.1 The optimum temperature of Chaenomeles peroxidase

1.2.3.4 底物浓度的影响 在25℃的条件下,分别改变愈创木酚和H2O2的浓度,470nm测定酶活性,采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)[16],分别求出POD对于底物愈创木酚和H2O2的米氏常数。

1.2.3.5 抑制剂和表面活性剂的影响 将各种金属离子及表面活性剂与底物混合成终浓度分别为1、5、10mmol/L的溶液,于25℃条件下反应20min,470nm测定酶活性。以不含金属离子时的酶活性为100%。

1.2.4 数据处理方法 实验数据用DPS v3.01专业版和Excel 2003处理。

2 结果与分析

2.1 POD最适温度

温度对酶促反应的影响很大,在最适温度下,POD活性可以达到最大。POD活性与温度的关系见图1,温度对品种B、C的影响相似,随着温度升高,POD活性均呈现先上升后下降的趋势,35℃以后下降较大,B的POD最适反应温度为30℃,C的最适作用温度为40℃,而品种A的温度影响趋势则不同,在低于35℃条件下酶活性均较高,之后迅速降低,最适反应温度为25℃。

2.2 温度稳定性

如图2所示,三个品种的POD在10、20℃保存60min,都能较好的保持活性,而在30℃保存60min后,品种A损失大约70%的酶活性,品种B和C损失约60%酶活性。在40℃保存20min之后,三个品种的POD均失活。可见三个品种皱皮木瓜的POD受温度的影响均较大,稳定性较差。

图2 不同品种皱皮木瓜POD的温度稳定性Fig.2 Temperature stability of Chaenomeles peroxidase

2.3 最适pH

由图3可以看出,每个品种的POD都有两个最适pH,其中一个最适pH在三个品种中均为5,品种A的另一个最适pH大约在7左右,品种B的另一个最适pH为6,品种C的另一个最适pH为6.5,该性质与番木瓜中POD的性质相似,其最适pH也有两个,分别为5.5和6.0[17]。

图3 不同品种皱皮木瓜POD的最适pHFig.3 The optimum pH of Chaenomeles peroxidase

2.4 pH稳定性

由图4可以看出,三个品种的POD的pH稳定性差别很大。品种A的POD的活性随着pH的增大而逐渐增强;而B的POD活性随pH的增大呈现降低趋势,在pH9时保存6h之后,酶活性可损失60%。品种C的POD活性受pH影响不大,在酸性条件下较稳定,略高于碱性条件下,但碱性条件下的稳定性也高于B。

图4 不同品种皱皮木瓜POD的pH稳定性Fig.4 pH stability of Chaenomeles peroxidase

2.5 不同金属离子的影响

不同金属离子对三个品种皱皮木瓜中POD活性的影响如表2所示。金属离子对三个品种POD活性的影响不尽相同。Ca2+对A、C的POD活性都有明显的激活作用,在低浓度时激活作用对A显著于C,而在1、10mmol/L时,对B起抑制作用;Mn2+则对三个品种的POD活性有较强的抑制作用,并且在10mmol/L时,三个品种间C

表2 不同金属离子对POD活性的影响Table2 Influence of metal ions on Chaenomeles peroxidase activity

注:三个品种A、B、C之间的多重比较,a,b,c:p<0.05,字母不同表示在0.05水平上有显著差异;A,B,C:p<0.01,字母不同表示在0.01水平上有极显著差异。

表3 不同品种皱皮木瓜POD的米氏常数方程Table3 The Km for different cultivars of Chaenomeles peroxidase

2.6 底物浓度的影响

在同样的反应条件下,固定愈创木酚的浓度,研究不同品种的POD作用于不同浓度H2O2时的反应动力学,固定H2O2浓度不变,研究不同品种的POD作用于不同浓度愈创木酚时的反应动力学。分别以1/[S]为横坐标,1/V为纵坐标,采用双倒数作图法,所得线性方程如表3所示,拟合得到的直线相关系数均大于0.99,说明三个品种木瓜中 PPO 催化的酶褐变反应均符合米氏方程。

通过线性方程分别求得POD的Km值,Km值的大小可近似地表示酶与底物的亲和力,Km值越大表示酶与底物的亲和力越小,反之,Km值越小表示亲和力越大。如表3所示,品种B中POD与H2O2的结合能力最强,A中的POD与愈创木酚的结合能力最强。

2.7 抑制剂和表面活性剂的影响

表4结果显示抑制剂和表面活性剂均能在一定程度上抑制POD的活性,其中,SDS的抑制能力最强,在质量体积比为0.1% 时可以完全抑制A、C中POD的活性,在0.2%时能完全抑制B的POD的活性。其余化合物的抑制能力均随浓度的增大而增强,在浓度为10mmol/L时,大部分的化合物可以完全抑制POD的活性。

比较各种化合物对A、B、C的抑制能力,可以看出,各化合物对A的POD的抑制能力最强,而对B、C的抑制能力则相对较弱,Na2SO3、DTT、Triton X-100、吐温-80对品种B、C的抑制力差异不显著。其中,在三个浓度范围内,EDTA-2Na对三个品种的POD活性的抑制能力差异显著,在高浓度时,抑制能力依次为C

表4 抑制剂和表面活性剂对POD活性的影响Table4 Influence of inhibition dose and surfactant on peroxidase activity

注:三个品种A、B、C之间的多重比较,a,b,c:p<0.05,字母不同表示在0.05水平上有显著差异;A,B,C:p<0.01,字母不同表示在0.01水平上有极显著差异。3 结论与讨论

品种A、B、C中POD的最适温度分别为20、25、30℃,三个品种都在20℃以内能较好的保持活性。三个品种的POD都有两个最适pH,分别为5和7,5和6,5和6.5,pH稳定性范围分别在7.5～9,3～6,3.5～7。金属离子对A、B的影响基本相同,而大部分的离子对C的影响不同于A和B。抑制剂对三个品种的抑制能力最强的是SDS,其次为抗坏血酸。

由不同的性质可以看出,虽然同为皱皮木瓜,不同品种的POD酶学性质差别还是很大,品种间差异明显。温度稳定性没有差异,都在20℃以内能较好的保持活性。三个品种的POD都有两个最适pH,说明皱皮木瓜中的POD可能存在两个亚基或者存在同工酶,此问题有待于进一步研究。而A和B的POD的pH稳定性则出现完全相反的趋势,A在碱性条件下稳定,B则在酸性条件下相对稳定。抑制剂和表面活性剂对A、B、C的POD的影响规律基本相同,只是抑制能力不同,对B、C的抑制能力最弱。金属离子对三个品种的皱皮木瓜POD活性均有不同的影响,钙离子会显著增强A、C的POD的活性,在加工和贮藏过程中应注意排除此离子,以防止木瓜品质变化。

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Study on the characterization of POD from different cultivars ofChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakai

SONG Shuang-shuang1,2,WANG Xiao1,DU Jin-hua2,LIU Feng1,DAN Staerk1,GENG Yan-ling1,CUI Li1,*

(1.Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Sciences,Jinan 250014,China;2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China)

The peroxidase was isolated fromChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakaiby Tris-HCl buffer. With guaiacol-H2O2as substrate,the enzyme characterization of threeChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakaicultivars was monitored by measuring the absorbance. In YATS 066(A),YATS153(B),YATS251(C),the results showed that the optimum temperature for POD activity were respectively 20,25,30℃. The POD of all cultivars could keep stabilized under 20℃. The peroxidases of three cultivars all had two optimum pH. And the pH stability range was at pH7.5～9,pH3～6,pH3.5～7. Metal ions had the same effects on the POD activity of A,B and C. The optimum inhibitor of POD activity in all threeChaenomelesspiciosa(Sweet)Nakaicultivars was SDS,and then followed by ascorbic acid.

Chaenomelesspiciosa(Sweet)Nakai;peroxidase;enzyme characterization

2014-06-30

宋双双(1989)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通讯作者:崔莉(1983-)，女，博士，助理研究员，研究方向：天然产物资源开发。

山东省海外高层次人才资助专项资金；山东省分析测试中心科技发展基金。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0152-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.025