银杏愈伤组织黄酮提取条件的正交实验优化

梁文惠,黄 翔,林丽春,夏年益,张 珣,彭春林,丘 添,施晓宇,邓祥宜

(华中农业大学楚天学院食品与生物科技学院,湖北武汉 430205)



银杏愈伤组织黄酮提取条件的正交实验优化

梁文惠,黄 翔,林丽春,夏年益,张 珣,彭春林,丘 添,施晓宇,邓祥宜*

(华中农业大学楚天学院食品与生物科技学院,湖北武汉 430205)

以银杏愈伤组织为材料,对银杏黄酮的提取条件进行优化。通过单因素实验研究乙醇浓度、液料比、微波功率、微波时间、水浴温度、水浴时间等对黄酮得率的影响,并进行了正交实验优化。正交实验的结果表明:以40%乙醇为提取溶剂,液料比25∶1,在中火档(528W)微波60s,不进行水浴处理,黄酮得率达到20.92mg/g。

银杏愈伤组织,黄酮,提取条件优化,正交实验,微波处理

银杏黄酮具有抗衰老、提高免疫机能、防治心血管病的作用[1-2]。国际市场上的天然药物中银杏黄酮制剂是用量最大的种类之一,银杏保健食品也很受人们青睐。随着我国人口老龄化的快速发展,心血管疾病发病率的增加,银杏黄酮相关的药品和保健品产业将会持续发展。目前银杏黄酮主要从叶片中提取,近年来,银杏叶中黄酮提取方法的研究也较多[3-7]。但大面积栽培银杏占用大量耕地,给农业生产造成一定影响;同时叶片中的药用成分含量比较低,提取工艺复杂,易受季节限制[8]。利用组织培养大规模生产黄酮、银杏内酯等药用成分,不但可以节省土地资源,而且可以提高生产效益。人们对银杏愈伤组织的诱导、继代进行了研究[8-9],但对愈伤组织中黄酮提取条件的研究较少。本文通过单因素实验和正交实验优化了微波法提取银杏愈伤组织中黄酮的相关条件,以期为组织培养法生产银杏黄酮的研究和生产实践作铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏愈伤组织 华中农业大学楚天学院实验教学中心;芦丁标准品 国药集团化学试剂有限公司;其它试剂均为分析纯。

电热恒温鼓风干燥箱DH6-914385-Ⅲ 上海新苗医疗器械制造有限公司;电子天平FA2104B 上海越平科学仪器有限公司;高速离心机TDL-5-A 上海安亭科学仪器厂;微波炉P80D23N1P-B5(B0) 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司;数显恒温水浴锅HH-6 国华电器有限公司;分光光度计722 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料培养及处理 愈伤组织培养以MS培养基外加0.5mg/L NAA,0.25mg/L 6-BA、1%琼脂和3%的蔗糖为继代培养基,培养温度25±1℃,避光培养75d后收获。120℃灭酶10min,60℃烘干至恒重,研磨后过60目筛得到银杏愈伤组织粉末,干燥器中保存备用。

1.2.2 黄酮提取工艺流程 银杏愈伤组织粉末→加入乙醇水溶液→摇匀后微波处理→(水浴浸提)→4000r/min离心15min→取上清液测定黄酮含量,计算得率。

1.2.3 黄酮测定方法 黄酮含量测定方法采用Al(NO3)3显色法,参照文献[4,10],略有改动,具体操作如下:

芦丁标准曲线的绘制:准确称取25mg芦丁标准品,用80%(v/v)乙醇溶液溶解,定容到250mL,得0.1mg/mL的芦丁标准液。取6支(编号0、1、2、3、4、5)25 mL的比色管,依次加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL芦丁标准液,再分别加80%(v/v)的乙醇溶液至5mL,摇匀;各加入5%的NaNO2溶液0.3mL,摇匀,静置5min;各加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL,摇匀,静置6min;再各加入1mol/L的NaOH溶液4mL,定容至10mL,充分摇匀,以0号比色管为参比,在510nm下测定1-5号比色管的吸光度,以芦丁含量(mg)为横坐标,以吸光度(A510)为纵坐标作芦丁标准曲线。

提取液中黄酮含量测定:取适量体积(V1)的提取液加入25mL的比色管中,按上述标准曲线中的方法进行定容、显色、测定吸光值,参照标准曲线计算黄酮含量(x1),进而计算黄酮得率:

V1:分光光度法测定黄酮含量所用提取液体积;x1:所用提取液中的黄酮含量(参照标准曲线计算);V总:提取液总体积。

1.2.4 单因素实验方法

1.2.4.1 乙醇浓度的优化 称取7份0.2g干燥银杏愈伤组织粉末置于7个10mL离心管中,然后向每支离心管中分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(v/v)的乙醇水溶液5mL,摇匀,将离心管(每次4支,不足时用装等体积水的离心管补齐)放入微波炉中,解冻档微波60s(每5s取出水浴冷却1次,摇匀后继续进行微波)。再放入80℃水浴锅中水浴2h(每15min摇匀1次)。水浴结束后,4000r/min离心15min,吸取上清液按照1.2.3中方法测定黄酮含量,计算黄酮得率。每个梯度做两组平行实验,结果以平均值±标准差表示。绘图分析乙醇浓度对黄酮得率的影响。

1.2.4.2 液料比的优化 保持提取剂(40%乙醇)体积为5mL不变,改变粉末重量,研究不同液料比(10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、100∶1)对黄酮得率的影响。其他条件参数参见1.2.4.1。

1.2.4.3 微波功率的优化 研究不同微波功率(低火、解冻、中火、中高火、高火档,对应的功率值分别为136、296、528、680、800W)对黄酮得率的影响。提取剂为40%乙醇,液料比为25∶1,其他条件参数参见1.2.4.1。

1.2.4.4 微波时间的优化 研究不同微波时间(0、10、20、40、60、80、100、120、140s)对黄酮得率的影响。提取剂为40%乙醇,液料比为25∶1,微波功率为解冻档(296W),其他条件参数参见1.2.4.1。

1.2.4.5 水浴温度的优化 研究不同水浴温度(50、60、70、80、90℃)对黄酮得率的影响。提取剂为40%乙醇,液料比为25∶1,微波功率为解冻档(296W),微波时间为60s,其他条件参数参见1.2.4.1。

1.2.4.6 水浴时间的优化 研究不同水浴时间(0、1、2、3、4、5h)对黄酮得率的影响。提取剂为40%乙醇,液料比为25∶1,微波功率为解冻档(296W),微波时间为60s,水浴温度80℃,其他条件参数参见1.2.4.1。

1.2.4.7 提取次数的选择 研究提取次数(1、2、3次)对黄酮得率的影响。提取剂为40%乙醇,液料比为25∶1,微波功率为解冻档(296W),微波时间为60s,水浴温度80℃,水浴时间2h,其他条件参数参见1.2.4.1。

1.2.5 正交实验方法 在单因素实验基础上,按照正交表L9(33)安排实验(见表1),通过极差分析找出最优组合,3因素外的其它条件为单因素实验最优条件。并在正交实验获得的最优条件下进行4次平行实验,以验证结果的可靠性。

表1 正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁含量(mg)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制芦丁标准曲线,见图1。所得回归方程为y=1.233x-0.0029,R2=0.9995,方程线性关系很好。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The rutin calibration curve

2.2 单因素实验结果及分析

2.2.1 不同乙醇浓度对黄酮得率的影响 不同乙醇浓度对黄酮得率影响的实验结果(图2)表明:乙醇浓度为30%时,黄酮的得率为18.89mg/g,随着乙醇浓度的升高,黄酮得率逐渐升高,在乙醇浓度为40%时得率达到最大,为21.01mg/g,当乙醇浓度超过40%时,黄酮得率反而随着乙醇浓度的升高而降低。这可能是因为在银杏愈伤组织中黄酮以黄酮糖苷的形式存在,有一定的亲水性,乙醇浓度过大反而不利于其溶解。因此,40%乙醇为本实验的最佳浓度。

图2 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

2.2.2 不同液料比对黄酮得率的影响 不同液料比对黄酮得率影响的实验结果(图3)表明:液料比为10∶1时,黄酮得率为7.97mg/g;随着液料比的增大,黄酮得率迅速上升,当液料比为25∶1时,黄酮得率为21.28mg/g;之后,黄酮得率仍随着液料比的增大而上升,但上升趋势逐渐减小。由此可知,液料比的提高有利于总黄酮的提取,这可能是因为随着溶剂的增加,黄酮扩散出来的传质动力也加大。工业生产中,由于液料比的增大而使得容器利用效率降低和后续浓缩困难。从节省提取剂、提高容器利用效率以及便于后续浓缩、纯化处理等角度考虑,本实验选择液料比25∶1为最佳液料比。

图3 液料比对黄酮得率的影响Fig.3 The effect of liquid-powder ratio on the extraction rate

2.2.3 不同微波功率对黄酮得率的影响 不同微波功率对黄酮得率影响的实验结果(图4)表明:低火档(136W)时黄酮得率较低,随着火力增强黄酮得率有所增加,在中高火档(680W)时达到最高,为22.15mg/g,而高火(800W)时黄酮得率出现下降。这可能是由于过高的微波功率对黄酮类物质有破坏作用,导致得率下降。因此,选择中高火档(680W)为本实验最佳提取功率。

图4 微波功率对黄酮得率的影响Fig.4 The effect of microwave power on the extraction rate

2.2.4 不同微波时间对黄酮得率的影响 不同微波时间对黄酮得率影响的实验结果(图5)表明:微波时间为0s时,黄酮得率为17.19mg/g,随着时间的延长,黄酮得率迅速增加,当微波时间为40s时,黄酮得率达20.86mg/g,超过40s后,黄酮得率随着处理时间的延长呈现震荡并缓慢上升的趋势。因此,可认为最佳微波时间为40s。

图5 微波时间对黄酮得率的影响Fig.5 The effect of microwave processing time on the extraction rate

2.2.5 不同水浴温度对黄酮得率的影响 不同水浴温度对黄酮得率影响的实验结果(图6)表明:水浴温度为50℃时,黄酮得率为21.28mg/g,随着水浴温度的升高,黄酮得率在整体上呈现先上升后下降趋势,在70℃时黄酮得率达到最大,为22.09mg/g。70℃之后得率随温度升高有下降趋势。这可能是因为温度升高有利于黄酮类物质溶出,但温度过高又可能对黄酮类物质有一定破坏作用。因此选用70℃为最佳水浴温度。

图6 水浴温度对黄酮得率的影响Fig.6 The effect of water bath temperature on the extraction rate

2.2.6 不同水浴时间对黄酮得率的影响 不同水浴时间对黄酮得率影响的实验结果(图7)表明:当水浴时间为0h时,黄酮得率为19.58mg/g;水浴2h时,黄酮得率出现峰值,为20.66mg/g;2h以后,得率则随着时间的延长呈现下降趋势。这是因为:在2h内黄酮化合物不断溶出,从而浸提时间越长黄酮得率越高;2h后,黄酮化合物溶出不再明显,而且由于长时间处于高温状态,可能导致黄酮化合物结构发生变化而失活,从而随着浸提时间的延长,黄酮得率呈现下降趋势。

水浴2h时的黄酮得率最大,为20.66mg/g,但与水浴0h的黄酮得率19.58mg/g相比,仅提高了1.08mg/g(约5.5%),从简化提取工序、降低能耗等角度出发,水浴0h(即不进行水浴处理)为最佳选择。

图7 水浴时间对黄酮得率的影响Fig.7 The effect of water bath processing time on the extraction rate

2.2.7 不同提取次数对黄酮得率的影响 不同提取次数对黄酮得率影响的实验结果(图8)表明:第1次的黄酮得率达到了21.17mg/g,占前3次总得率的77.95%;第2次的黄酮得率为4.40 mg/g,占前3次总得率的16.20%;第3次的黄酮得率为1.59mg/g,只占前3次总得率的5.85%。提取次数增多可以提高累计得率,但增加提取次数会成倍地增加乙醇用量、操作时间等成本,而黄酮产量增加却很少。因此生产中选择1次提取为最优。如果是实验中为了考察愈伤组织中的真实含量,可提取两次,此时累计得率占总得率的94.15%,基本可以代替材料中的总黄酮含量。

图8 提取次数对黄酮得率的影响Fig.8 The effect of extraction times on the extraction rate

2.3 正交实验结果及分析

根据单因素实验结果,从提取工艺中去掉水浴处理过程,选取微波功率、乙醇浓度、微波时间进行3因素3水平的正交实验设计,其余条件为单因素实验的最优条件。正交实验结果(表2)表明:各因素对黄酮得率影响的大小次序依次为:乙醇浓度>微波时间>微波功率。黄酮得率最高的优水平组合是A1B2C3,即微波功率为中火档(528W),提取溶剂为40%乙醇,微波时间为60s,其余条件为单因素最优条件。

验证性实验结果(表3)表明:在正交实验最优条件下,黄酮得率达到20.92±0.28mg/g,考虑到实验误差,高于正交实验中其他梯度,因此正交实验结果可信。

表2 L9(33)正交实验结果Table2 The result of the L9(33)orthogonal experiment

表3 验证性实验结果Table3 The result of verification experiment

3 结论与讨论

本研究通过单因素实验和正交实验,得到了银杏愈伤组织黄酮提取的最佳条件:以40%乙醇为提取溶剂,液料比25∶1,在中火档(528W)微波60s,黄酮得率最高,单次提取的黄酮得率达到20.92mg/g。这比很多文献中银杏叶片黄酮的得率明显高一些,因为叶片中黄酮化合物总含量才20mg/g左右,单次提取的黄酮得率更低,如:18.38mg/g[4]、8.28mg/g[5]、12.91mg/g[6]。同时银杏愈伤黄酮得率也高于银杏外种皮,因为银杏外种皮中总黄酮含量才12.15mg/g[11]。故利用银杏愈伤组织生产黄酮具有一定的市场潜力。

本研究中,微波处理能显著提高黄酮得率,这是因为微波处理能破坏细胞结构,同时微波处理附带的热效应也能增加黄酮溶出速率[12]。但是处理时间过长,往往会导致黄酮得率降低[5,13],这是因为微波长时间作用后产生高温,导致以槲皮素为甙元的黄酮甙发生了分解[14]。本实验中,微波处理采取每处理5s水浴冷却一次的方法进行,避免了由微波处理导致温度过高而破坏黄酮,所以微波处理时间增加有利于黄酮的提取,而且没有出现时间过长导致黄酮被破坏。

实验中,微波处理后的水浴浸提过程效果不明显,从简化工艺、降低能耗的角度出发,将水浴处理步骤从最终工艺中舍去。短暂的微波处理能代替长时间的水浴过程,这说明了微波提取法在银杏愈伤组织黄酮提取中的高效性。

实验中发现40%乙醇做提取剂时银杏愈伤组织黄酮得率最高，而文献中银杏叶片黄酮提取需要较高的乙醇浓度,如:83%[4],63%[5]、72.95%[6]。这可能是因为愈伤组织中的黄酮糖苷亲水性比叶片中的强,具体原因还有待于进一步的研究。

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Optimization of extracting conditions of flavonoids fromGingkoCallus by orthogonal experiment

LIANG Wen-hui,HUANG Xiang,LIN Li-chun,XIA Nian-yi,ZHANG Xun,PENG Chun-lin,QIU Tian,SHI Xiao-yu,DENG Xiang-yi*

(College of Food & Life Science and Technology,Chutian College Huazhong Agricultural University,Wuhan 430205,China)

UsingGinkgocallus as material,the optimization of the extraction conditions ofGinkgoflavonoids was done. Through single-factor tests,the influences of several factors on extraction rate ofGinkgoflavonoids were investigated,such as ethanol concentration,liquid-powder ratio,microwave power,microwave processing time,water bath temperature,water bath processing time,etc. Then,orthogonal test was carried out. The results of orthogonal experiment indicated that:using 40% ethanol as the extraction solvent,liquid-powder ratio 25∶1,microwave processing 60s under middle power level(528W),no water bath treatment,the extraction rate of flavonoids reached 20.92mg/g.

GingkoCallus;flavonoids;optimization of extraction conditions;orthogonal experiment;microwave process

2014-08-07

梁文惠(1987-)，女，在读本科生，研究方向：植物细胞工程与天然活性产物提取。

*通讯作者:邓祥宜(1984-)，男，硕士，讲师，研究方向：植物细胞工程与天然活性产物提取。

国家级大学生科技创新项目(201314035001)；校级大学生科技创新项目(201201)。

TS205

B

:1002-0306(2015)09-0209-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.037