D异抗坏血酸棕榈酸酯(IP)的抗氧化特性研究

王应强,崔凤杰,赵红霞,2,孙文敬

(1.陇东学院农林科技学院,甘肃庆阳 745000；2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013；3.江西省生物发酵食品添加剂工程技术研究中心,江西德兴 334221)



王应强1,崔凤杰2,3,赵红霞1,2,孙文敬2,3

(1.陇东学院农林科技学院,甘肃庆阳 745000；2.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013；3.江西省生物发酵食品添加剂工程技术研究中心,江西德兴 334221)

考察了酶法合成的D-异抗坏血酸棕榈酸酯(IP)在模拟体系和食用油中的抗氧化能力,并和常用抗氧化剂进行了对比。结果表明:IP的抗氧化能力呈一定的剂量效应关系；与L-抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、叔丁基对甲氧酚(BHA)及叔丁基对甲苯酚(BHT)相比,IP具有更强的羟基自由基清除能力和还原能力,但清除超氧阴离子及DPPH·自由基方面,略低于TBHQ；在油脂加速氧化实验中,IP能够显著抑制大豆油和菜籽油的氧化酸败。

D-异抗坏血酸棕榈酸酯,抗氧化剂,抗氧化特性

通过对维生素进行结构改性以增强其稳定性和扩大其应用范围,是目前食品添加剂生产技术领域的研究热点之一[1]。目前,多种经过结构修饰的维生素衍生物已实现商品化,广泛用作食品添加剂、药品或保健品[2],例如,改性后的维生素C酯[3]、维生素E酯和维生素A 酯等作为其母体维生素替代品在食品、医药、化妆品和饲料等行业被广泛应用。

影响维生素衍生物功能特性的因素包括维生素和酯化反应脂肪酸的种类。D-异抗坏血酸(Erythorbic Acid,EA)是L-抗坏血酸(维生素C)的光学异构体,作为一种安全、高效的食品抗氧化剂,已被FDA(美国食品及药物管理局)列为一般公认安全物质(Generally Recognized as Safe,GRAS)。目前VC脂肪酸酯的研究较多,例如合成的L-抗坏血酸棕榈酸酯由于其脂溶性显著增强,且抗氧化效果明显优于常用的抗氧化剂BHA、BHT和TBHQ等,故已广泛应用于各种肉制品、面食品和保健品等[4]。与VC相似,D-异抗坏血酸具有较强的亲水性,但其在脂溶性体系中溶解性能很差,这极大地限制了其在油脂类食品和化妆品中的应用[5]。 因此,对D-异抗坏血酸进行结构修饰,使其变成强脂溶性及稳定性更高的D-异抗坏血酸酯化衍生物,是拓展D-异抗坏血酸应用范围的有效途径之一。但目前D-异抗坏血酸衍生物合成的相关研究报道较少,为此,我们已经利用固定化脂肪酶催化D-异抗坏血酸分子上的羟基与棕榈酸上的羧基发生酯化,得到具有两性结构的D-异抗坏血酸棕榈酸酯(IP)[6]。

本文首先从清除自由基及还原力测试等人工生成的自由基来评价D-异抗坏血酸棕榈酸酯(IP)体外抗氧化性能；然后进一步采用Schaal烘箱法考察了其对延长大豆油和菜籽油贮藏稳定性的影响,从而评估了该酯化衍生物的抗氧化性能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-异抗坏血酸棕榈酸酯(IP)(纯度>95%),按照文献[4]实验室自制；二苯基苦味肼(DPPH) 购自Sigma公司；铁氰化钾,碘化钾,邻二氮菲,FeSO4均为分析纯 购自国药集团化学试剂有限公司；D-异抗坏血酸(Erythorbic Acid,EA)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)及L-抗坏血酸棕榈酸酯AP 均为食品级；菜籽油和大豆油 均由大丰市佳丰油脂有限公司提供。

紫外可见分光光度计(UV-2500) 上海元析仪器有限公司；紫外分光光度计(Varian cary 100) 美国瓦里安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 IP对超氧阴离子自由基清除能力的测试 参照何玲玲[7]等人的方法,并略作改进:4.2mL不同质量浓度的IP样品在25℃水浴锅中保温20min后迅速加入在25℃水浴中预热的邻苯三酚(3mmol/L)0.3mL,混匀后迅速倒入比色皿,在波长325nm处测A值10次,时间间隔为30s,通过A值计算待测溶液吸光度随时间的变化率FX。以去离子水作为空白,测定时,以10mmol/L HCl代替邻苯三酚,每个质量浓度样品重复3次,同时以市售的TBHQ、BHT、BHA、AP作比较。结果按下式计算:

F0:对照溶液吸光度随时间的变化率；Fx:溶液吸光度随时间的变化率。

1.2.2 IP对羟基自由基清除能力的测试 参照Yang[8]等人描述的Fenton反应法测定IP清除羟基自由基的能力并略作改进:首先,将样品用甲醇溶解,配制成不同的浓度,然后分别取1mL溶解液加入到反应体系中,该反应体系包括；1mL邻二氮菲无水乙醇溶液(0.75mmol/L)、2mL 的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(0.2mmol/L)、1mL硫酸亚铁溶液(0.75mmol/L)及1mL H2O2(0.01%)。以蒸馏水取代样品作为对照组,以蒸馏水代替H2O2作为空白对照,反应混合液在37℃的水浴锅中保温1h后在波长536nm处测吸光度,每个质量浓度重复3次,同时与市售TBHQ、BHA、BHT和AP做比较。样品对羟自由基的清除率按以下公式计算:

1.2.3 IP对DPPH自由基清除能力的测定 DPPH·(二苯基苦味肼自由基)是一种溶解于乙醇溶液,并在517nm处有强吸收并呈紫色,用以稳定氮为中心的自由基,目前被广泛应用于生物试样的抗氧化能力的测定。将IP粉末溶解于乙醇溶液中,配制不同质量浓度的IP,然后分别取1mL溶解液加入2mL DPPH 乙醇溶液(0.2mmol/L)迅速混匀后置于室温黑暗下30min,在波长517nm 处测定吸光度值Ai；用无水乙醇代替样品测得A0;以无水乙醇代替DPPH乙醇溶液测得Aj,以无水乙醇调零[8]。每个样品浓度重复3次,同时与市售BHT、BHA、THHQ和AP进行比较。样品对DPPH·的清除率按下式计算:

1.2.4 IP的还原能力的测定 IP还原能力的测定采用普鲁士蓝法,反应原理是铁离子遇到亚铁氰根产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀。将样品溶解在甲醇中,配成不同质量浓度的样品液,测定时取0.5mL IP样品溶液,依次与2.5mL pH6.6的磷酸缓冲溶液(0.2mmol/L)和2.5mL的铁氰化钾(1%)混合,再在50℃水浴锅中保温20min,冷却后加入2.5mL三氯乙酸溶液(10%),待混匀后在2000r/min 离心10min后,取上清液2.5mL,并与蒸馏水2.5mL及0.1% 三氯化铁溶液0.5mL混合并室温静置10min后,在波长700nm 处检测吸光值[9]。每个质量浓度做3个平行,同时与市售TBHQ、BHA、BHT和AP做比较。

1.2.5 IP对食用油氧化的抑制效应 强制氧化实验利用Schaal烘箱法[10]。按油质量分数的0.02%将IP分别添加到鲜榨的菜籽油和大豆油中,待样品充分溶解后,转入(60±2)℃的恒温培养箱中进行强制氧化,分别参照测定油样的过氧化值(POV)国标(GB/T 5009.37-2003)和酸价(AV)国标(GB/T 5009.37-2003)用碘量滴定法分别测定,观察数值的变化趋势。同时与TBHQ、BHA、BHT和AP及空白做比较,评价IP在油脂中的抗氧化能力。

1.2.6 数据处理 数据用SPSS 15.0.1进行统计学分析,表示为x±SD,均值之间的显著性采用Duncan’s Multiple Range test,当p≤0.05时认为平均值之间有显著差异。

2 结果与分析

2.1 IP对超氧阴离子自由基清除能力

本文选浓度为0.02～0.25mg/mL,测试超氧阴离子自由基的清除能力,并与BHT、BHA、AP和TBHQ进行比较,结果如图1所示。各试样除TBHQ外,清除超氧阴离子自由基的能力均随着样品质量浓度的增加,表现出上升趋势,并显示出一定的量效关系。IP在该实验中表现出与BHA 相当的清除能力,当浓度增大到0.25mg/mL时,达到最大清除率为54.29%,仅次于AP与TBHQ,且这五种抗氧化剂的清除能力大小依次为:AP>TBHQ>IP>BHA>BHT 。

图1 IP对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.1 Superoxide radical scavenging activity of IP

2.2 IP对羟基自由基清除能力

羟基自由基(·OH)是具有激发油脂过氧化反应的强氧化剂,也是脂质过氧化过程的快速诱发剂[11]。IP与BHA、BHT、TBHQ及AP的清除羟自由基能力的结果如图2所示。从图中可以看出,随着浓度的增加,各样品的清除羟自由基能力增大,且表现出一定的量效关系。在浓度为0.25mg/mL时,IP(120.83%)与BHA(139.58%)、BHT(137.50%)、TBHQ(127.78%)及AP(130.56%)的清除能力很接近。虽然当浓度增加到0.4mg/mL时,IP的清除羟自由基能力开始随着浓度的增加出现下降,但是在整个过程中IP表现出良好的清除羟自由基能力。

图2 IP对羟基自由基的清除能力Fig.2 Hydroxy radical scavenging ability of IP

2.3 IP对DPPH自由基清除能力

DPPH自由基法是一种被广泛用于评价抗氧化剂清除自由基能力的快速方法[12]。检测原理是IP提供电子与DPPH·的孤对电子配对,使DPPH·在517nm波长处的特征紫消失或减弱[13-16]。被测样品对DPPH表现出了有效的清除,则证明样品具有中断脂质过氧化链反应、减小羟基和烷基自由基的作用。DPPH溶液的变色程度反映了抗氧化物对DPPH的清除能力。由图3可见,各样品均表现出DPPH有一定的清除能力,且当浓度增大时,清除率也增大。当样品质量浓度达到0.01mg/mL 时,IP对DPPH的清除率分别可达到70%以上,并趋于稳定,且效果明显优与BHT和BHA,略逊于TBHQ。所有样品中,添加了TBHQ的样品表现出了最优的清除效果。各样品清除能力大小顺序为:TBHQ>IP>AP>BHT>BHA。在一定的质量浓度范围内,各样品的清除能力表现出与浓度成一定的量效关系。

图3 IP对DPPH·的清除能力Fig.3 DPPH· free radical scavenging ability of IP

2.4 IP的还原能力

物质的还原能力是用于评价物质抗氧化活性能力强弱的指标,若物质的还原能力强,则供应的电子不仅满足还原氧化性物质,且多余的电子还可以稳定自由基,通过与自由基发生反应,进而减少了对生物体造成伤害的可能[17]。

图4为IP与BHA、BHT、TBHQ及AP的还原能力的比较。在所有的测试抗氧化剂中,BHA的还原能力最差,在浓度0.2～0.5mg/mL范围内,TBHQ表现出了较强的还原能力,但是IP的还原能力较弱。在0.1～0.5mg/mL范围内,IP的还原能力表现出的差异不大(p>0.05),在浓度为0.5mg/mL下,各种抗氧化剂的还原能力大小为:TBHQ>BHT>AP>IP>BHA。当浓度增加到1mg/mL时,与所有的供试抗氧化剂相比,IP表现出明显的优势,各抗氧化剂的还原能力大小顺序为:IP>TBHQ>BHT>AP>BHA。实验结果表明,IP具有明显的潜力供应电子使其与自由基反应,从而把它们变成更稳定的非反应活性成分并且终止自由基链的反应。

图4 IP的还原能力Fig.4 Reducing ability of IP

2.5 IP在食用油中的抗氧化性能

2.5.1 IP对食用油POV值的影响 过氧化值(Peroxid value,POV)是衡量在脂质氧化的最初阶段形成的过氧化物和氢过氧化物浓度的指标,也是在食用油和脂肪中广泛用来测试氧化酸败的指标。

按照油脂中抗氧化剂使用卫生标准的规定,油脂中抗氧化剂的最大添加量为0.01%～1.0%之间,其中最常用量为0.02%,因此将不同的抗氧化剂按0.02%的添加量加入到鲜榨的大豆油和菜籽油中,利用Schaal烘箱法在(60±2)℃进行强制氧化30d,结果如图5所示。

图5 添加不同抗氧化剂的大豆油和菜籽油的过氧化值(30d)Fig.5 Peroxide value of the rapeseed oil and soybean oil including different antioxidants(30d)注：初始抗氧化值：大豆油:(7.13±0.68)meq/kg;菜籽油:(0.73±0.34)meq/kg。

从图5中可以看出,在利用Schaal烘箱法进行强制氧化作用下,与空白对照相比,被测试样的过氧化值(POV)值均低于空白值(p<0.05),这证明各种抗氧化剂的抗氧化效果有一定的差异,但是均对大豆油和菜籽油在抗氧化方面有一定的抑制作用。这种作用的强弱依次为:TBHQ>IP>AP>BHT>BHA。其中,在大豆油和菜籽油中IP作用下的油脂其抗氧化值(POV)由最开始的(7.13±0.68)meq/kg和(0.73±0.34)meq/kg经过30d上升到(54.67±0.68)meq/kg和(114.34±0.32)meq/kg,而空白值均高于250meq/kg,由此说明,IP既具有良好的脂溶性,又对大豆油和菜籽油表现出了良好的抗氧化效果。在整个实验中TBHQ的POV值始终保持最低,表现出显著的抗氧化活性[18-20]。

IP是通过具有抗氧化性质的EA和棕榈酸通过酯键结合在一起,不但避免了EA不溶于油的缺陷,保留了EA的生理功能,而且能很好地中断自由基的链式反应,且拥有其他抗氧化剂无法替换的优点,这将为EA扩大应用范围提供一定的理论参考。

2.5.2 IP对食用油酸价的影响 酸价AV是脂肪酸败评价的指标[21-22]。图6为在大豆油和菜籽油中分别添加了IP、AP、BHA、BHT、TBHQ及与空白相比下,在(60±2)℃下强制氧化储藏下30d油样的酸价。从图6可以看出,添加抗氧化剂油样的酸价明显比未添加抗氧化剂的酸价低(p<0.05)。在储藏30d后,大豆油和菜籽油空白酸价分别达到(0.53±0.09)mg/g和(0.50±0.07)mg/g。而添加了IP的样品均表现出较低的酸价,分别为(0.38±0.02)mg/g和(0.35±0.01)mg/g,而酸价最低的为添加了TBHQ的油样,酸价分别为(0.34±0.02)mg/g和(0.33±0.09)mg/g。添加各种抗氧化剂后酸价的大小顺序为:TBHQ>IP>BHT>AP>BHA。IP的抗氧化效果略低于TBHQ,这与前面的结论相一致。

图6 添加不同抗氧化剂的大豆油和菜籽油的酸价(30d)Fig.6 Acid value of the rapeseed oil and soybean oil including different antioxidants(30d)

3 结论

以D-异抗坏血酸和棕榈酸为原料,在非水相中酶催化合成的D-异抗坏血酸棕榈酸酯(IP),当浓度最大到0.25mg/mL时,对超氧阴离子自由基清除能力达到最大清除率为54.29%,仅次于AP与TBHQ,而对羟基自由基清除能力很接近。虽然当浓度增加到0.4mg/mL时,IP的清除羟自由基能力为开始随着浓度的增加出现下降,但是在整个过程中表现了良好的清除羟自由基能力；当样品质量浓度达到0.01mg/mL 时,IP对DPPH·的清除率分别可达到70%以上,并趋于稳定,且效果明显优于BHT和BHA；当浓度增加到1mg/mL时,与所有的供试抗氧化剂相比,IP的还原力表现出明显的优势。

Schaal烘箱法测试结果表明:在大豆油和菜籽油中IP作用下的油脂其抗氧化值(POV)由最开始的7.13±0.68meq/kg和0.73meq/kg经过30d上升到(54.67±0.68)meq/kg和(114.34±0.32)meq/kg,而空白值均高于250meq/kg,酸价测定结果也表明,IP的抗氧化效果明显,均优于BHT、BHA和AP,但略低于TBHQ。由此说明,IP既具有良好的脂溶性,又对大豆油和菜籽油表现出了良好的抗氧化效果。这对以D-异抗坏血酸为母体的D-异抗坏血酸衍生物的开发奠定了基础,对产物D-异抗坏血酸棕榈酸酯的食用安全性,包括体内体外毒理学评价等需进行进一步的研究,以期将其开发成商业化的脂溶性食品级抗氧化剂提供一定的基础。

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Study on antioxygenic activity ofD-isoascorbyl palmitate synthesized by lipase

WANG Ying-qiang1,CUI Feng-jie2,3,ZHAO Hong-xia1,2,SUN Wen-jing2,3

(1.College of Agriculture and Forestry,Longdong university,Qingyang 745000,China；2.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.Jiangxi Provincial Engineering and Technology Center for Food Additives Bio-production,Dexing 334221,China)

D-isoascorbyl palmitate(IP)was synthesized with lipase-catalyzed method and its antioxidant activity was evaluated in model systems and food oil systems compared with that of BHT(butylated hydroxytoluene),BHA(butylated hydroxyanisole)and TBHQ(tert-butyl hydroquinone). The results showed that IP had the higher scavenging effect on hydroxyl radical and reducing power compared with other tested antioxidants while it had slight lower superoxide anion and DPPH· scavenging powers than those of TBHQ. In the grease accelerated oxidation,IP showed significantly inhibited effect on oil rancidity.

D-isoascorbyl palmitate;antioxidant;antioxygenic activity

2014-07-11

王应强(1979-),男,博士,副教授,研究方向:食品工程与工艺。

陇东学院博士科研启动基金(XYBY11)。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0079-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.008