富硒毛竹林中硒赋存形态和分布规律研究

孟 勇，杨 明，李美群，艾文胜＊，漆良华

（1.湖南省林业科学院，湖南 长沙410004；2.国际竹藤中心，北京100102）

硒是环境中一种重要的生命元素，1817年被瑞典化学家发现，1932年在植物中检测出了硒［1-4］。1957年Sohwarz和Folzt证实硒是生命的要素后，学者对硒的研究重点从毒害转移到注重硒的营养作用［5］。在缺硒地区施加硒微肥或在高硒地区栽培富硒能力强的植物，对缺硒地区人民补充硒营养、治疗和预防硒缺乏症具有非常重要的应用价值［6］。近年来，人们对硒的认识已提高到一个新的高度，通过植物对硒的吸收、积累、转化作用了解硒对植物生长发育作用，以及植物在硒供应条件下自身代谢的变化，对系统了解植物的硒营养全貌并深入揭示其机理有重要的意义［7-8］。张檀［9］等对猴头菌进行富硒研究表明，猴头菌对硒的富集呈非线性规律，富硒猴头菌中有机硒的相对含量达到84.50%±4.16%。于忠禾［10］等对低硒地区玉米植株中硒的含量分布规律进行研究表明，玉米成熟期根系＞茎叶雄穗（混）＞籽粒，籽粒中含硒量非常低，灌浆期叶片＞茎秆＞根系＞雄穗＞雌穗，下部茎＞上部茎。用亚硒酸钠溶液浸种不利于提高玉米含硒量，叶喷可有效地提高玉米各器官含硒量，喷硒对玉米产量没有明显提高。吕金印［11］等用硒示踪法研究小麦幼苗对硒的吸收、分布及转运研究表明，小麦幼苗体内硒的分布并不均衡，根积累量最大，茎次之，叶片则根据叶龄而异；根茎及老组织中的硒有向生长部位转运的趋势，不同基因型的小麦对硒吸收量不同，筛选富硒基因型是可能的。以常规早稻为样本，对水稻的硒生物富集分布研究表明［12-13］，水稻对硒有一定的富集和较高的有机转化能力，积累分布于全株，成熟时各器官中硒的分布依次为：根＞剑叶＞茎＞叶片＞叶鞘＞穗，水溶性生物大分子中硒的分布为：蛋白质＞核酸＞多糖，说明植物所吸收的硒旺盛地参与了其新陈代谢。吴丽军［14］等研究油菜对硒的吸收、累积及分配规律结果表明，不同品种春油菜根、茎、叶、籽粒、角果壳硒含量均在角果期—成熟期达到最大值，主要分配于生殖器官（籽粒和角果壳），尤以角果壳中分配的最多。李瑜［15］等对不同器官马铃薯硒的吸收及生物富集规律进行研究，结果显示，马铃薯不同器官对硒的吸收富集能力不同，其富集规律为茎＞叶＞根＞块茎，马铃薯的茎干部位对硒的吸收能力较强，硒元素主要富集在马铃薯的茎干部位。

毛竹（Phyllostachys edulis）是我国重要的森林树种之一［16］，目前，关于毛竹富硒及硒在毛竹体内的吸收、积累、转化作用的了解不多。通过对毛竹进行竹腔注射富硒施肥，研究富硒毛竹各器官中硒的分布，了解硒元素在毛竹体内的吸收、转运和累计规律，为毛竹富硒培育提供技术支持和科学依据。

1 研究区概况

试验地位于湖南省长沙市望城区原佳村乌山林场 （112°40′-112°47′E，27°50′-27°53′N），属中亚热带季风湿润气候，气候温和，热量丰富，年平均气温17℃，降水量1 370mm，日照1 610h，无霜期274d，日均温≥10℃的活动积温5 376.9℃，1月平均气温为4.4℃，7月平均气温为30℃。试验区海拔130m，坡度20°，竹林平均立竹度2 661 株·hm-2，竹林平均胸径9.2cm。试验区土壤中全硒含量平均值为0.116 3mg·kg-1。

2 材料与方法

2.1 试验样地设置与富硒方法

2012年12月，在望城乌山林场毛竹纯林中选择立地条件、竹林结构相似的地点设置富硒施肥试验样地3个，样地与等高线平行，样地之间间隔5 m，清除杂灌木，为防止串鞭和营养元素的扩散，在样地外围0.5m处挖宽30cm、深50cm的隔离沟，样地大小为20m×20m。富硒肥采用含亚硒酸钠1.5mg·mL-1、硝酸钾15.0mg·mL-1、磷酸二氢钾8.0mg·mL-1、钼酸铵0.4mg·mL-1、硼酸2.0 mg·mL-1、EDTA-Na2Zn 1.0mg·mL-1、EDTANa2Mn 1.0mg·mL-1、NaFe-EDTA 1.0mg·mL-1的自制液态富硒肥。在样地内用便携式电钻在竹秆基部节间的上部钻孔，用医用注射器注射液态肥10mL·株-1，并用湿土封口。同时在试验样地水平间隔500m外设置对照样地3个，对照样地不采取富硒施肥措施，大小为20m×20m。

2.2 样品采集与测定方法

2013年4月，于竹林出笋盛期，在每个样地中随机采挖3～5株健康竹笋，将竹笋剥壳后混合并装入样品袋，在实验室检测全硒、蛋白结合态硒、多糖结合态硒、核酸结合态硒、无机硒含量；2013年9月，对样地竹株进行每竹检尺，调查竹株胸径、年龄、秆高、枝下高等数据，根据年龄、平均胸径、平均秆高选择标准竹，于6个样地内分别选取1龄、3龄、5龄标准竹各1株，共砍伐标准竹18株，将竹株伐倒后采集竹秆、枝条、竹叶不同部位的混合样品，同时挖开竹篼附近土壤，露出竹根、竹篼及相连的竹鞭，并采集竹篼、竹根、来鞭、去鞭等各器官样品。将样品用蒸馏水洗净并105℃烘干，粉碎过80目筛，检测全硒含量；另外，选择富硒施肥样地9株标准竹烘干、粉碎、过筛的竹叶样品，每个样品称取30g，均匀混合得到富硒毛竹竹叶混合样，按相同方法得到富硒毛竹竹根、竹秆、来鞭、去鞭混合样，将来鞭和去鞭的混合样再次混合得到富硒毛竹竹鞭混合样，在实验室检测富硒毛竹竹叶、竹根、竹秆、竹鞭混合样中蛋白结合态硒、多糖结合态硒、核酸结合态硒、无机硒含量。

2.2.1 全硒含量的测定 根据GB5009.93-2010《食品安全国家标准——食品中硒的测定》的方法进行硒含量检测，硒元素的检测设备为北京吉天仪器有限公司生产的原子荧光光度计，型号为AFS-830；

2.2.2 蛋白结合态硒测定 取样品5.0g，加50 mL丙酮，振荡脱脂3h，5 000r·min-1离心10min后弃上清，沉淀重复脱脂2次，挥干丙酮。沉淀中加入pH 8.5磷酸盐缓冲液20mL，振荡提取3h，5 000r·min-1离心10min后取上清液。残渣中加入10mL pH 8.5磷酸盐缓冲液重复提取2次，合并3次所得提取液。上清液加（NH）2SO4至饱和，4℃静置过夜。6 000r·min-1离心10min，弃上清，沉淀加混合酸（硝酸∶高氯酸为4∶1）10mL，冷消化过夜后根据GB5009.93-2010《食品安全国家标准——食品中硒的测定》的方法进行硒含量检测。

2.2.3 多糖结合态硒测定 取样品5.0g于三角瓶中，加入50mL丙酮，振荡脱脂3h，5 000r·min-1离心10min后弃上清，沉淀重复脱脂2次，挥干丙酮。沉淀加入双蒸水20mL，80℃水浴提取2 h，5 000r·min-1离心10min后取上清，重复提取2次，合并上清液。上清液加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）剧烈振荡脱蛋白，静置，取水相。加入4倍体积95%乙醇，4℃静置过夜。次日6 000r·min-1离心10min弃上清。沉淀用85%乙醇洗涤3次，加混合酸（硝酸∶高氯酸为4∶1）10mL，冷消化过夜后根据GB5009.93-2010《食品安全国家标准——食品中硒的测定》的方法进行硒含量检测。

2.2.4 核酸结合态硒测定 取样品5.0g，加pH 8.5Tris-HCL缓冲液20mL，提取4h，4 000r·min-1离心10min，收集上清液，沉淀加10mL pH 8.5Tris-HCL缓冲液重复提取2次，合并提取液，加蛋白酶5mL，30℃保温30min，再加10%SDS 2 mL，0.1mol·L-1巯基乙醇1mL，65℃保温30 min，用等体积氯仿／异戊醇（24∶1）震荡，4 000r·min-1离心10min，取水相加2／3体积异丙醇，震荡后置冰箱中4℃静置过夜，5 000r·min-1离心，沉淀加混合酸（硝酸∶高氯酸为4∶1）10mL，冷消化过夜后根据GB5009.93-2010《食品安全国家标准——食品中硒的测定》的方法进行硒含量检测。

2.2.5 无机硒含量的测定 取样品5.0g，加6 mol·L-1盐酸溶液25mL，70℃恒温水浴浸提2h，冷却至室温后过滤，取上清液置沸水浴中20min，冷却并过滤，上清液作为待测夜，以空白作对照，原子荧光光谱仪测定硒含量。

2.3 数据处理与分析

数据分析采用Excel和SPSS13.0进行处理［17］。

3 结果与分析

3.1 富硒毛竹各器官总硒含量分布

对富硒毛竹各器官进行全硒含量测定，结果表明（表1），富硒毛竹各器官全硒含量均高于未富硒毛竹。其中各器官全硒含量顺序为：竹叶（0.318 9 mg·kg-1）＞竹根（0.172 8mg·kg-1）＞去鞭（0.124 7mg·kg-1）＞竹篼（0.096 3mg·kg-1）＞来鞭（0.092 8mg·kg-1）＞竹秆（0.072 3mg·kg-1）＞竹枝（0.069 1mg·kg-1）＞竹笋（0.059 4 mg·kg-1），未富硒毛竹各器官硒含量分布规律为：竹叶＞竹根＞竹篼＞去鞭＞来鞭＞竹枝＞竹笋＞竹秆。各器官硒含量与对照相比提高了148.31%～391.64%，其中竹叶中全硒含量提高最多，竹篼的全硒含量提高最少。对各器官中全硒含量进行方差分析，结果表明各器官中全硒含量差异显著，硒元素在毛竹各器官中分布不平衡。竹秆和腔壁作为硒元素吸收和转运的重要器官，表现出相对较低含量的硒元素存在，且竹叶、竹根相对于施肥部位较远但硒元素含量却很高。竹叶、竹根中全硒含量明显高于其他器官，表明硒元素有向新陈代谢旺盛的部位转运和累积的趋势。竹鞭是毛竹地下鞭根系统输送养分、水分的主要器官，除竹叶、竹根外，竹鞭中总硒含量较高，这有利于硒元素在竹林中的扩散、吸收和利用，来鞭与去鞭中全硒含量之间差异不显著。

表1 各器官硒元素含量及多重比较Table 1 Selenium contents in different organs and multiple comparisons

对不同年龄富硒毛竹各器官总硒含量进行方差分析（表2），结果表明，竹篼中全硒含量随年龄变化有极显著性差异（F=9.596，p=0.014），表现出随年龄增加全硒含量先下降后上升的趋势，不同年龄毛竹其来鞭中硒元素含量也表现出显著差异（F=6.488，p=0.032），表现为随年龄增加，来鞭中硒元素含量逐渐增加的趋势，而其他器官全硒含量随年龄变化均无显著差异。试验竹林中竹鞭和竹篼中硒含量存在差异，说明硒元素在竹林地下系统中的运输和分配不均衡，除新陈代谢旺盛的叶、根部位表现为较高的硒含量外，较高年龄的篼、鞭中也表现出较高浓度的硒元素存在，这可能是因为随年龄增加，毛竹相关器官的输导能力减弱造成的。

3.2 富硒毛竹各器官硒元素含量之间的相关性

对富硒毛竹各器官全硒含量进行相关性分析。结果表明（表3），各器官中，来鞭与竹篼、去鞭与竹篼、竹秆与竹枝、来鞭与去鞭之间有显著的正相关关系，主要表现在相邻器官之间，而新陈代谢旺盛的器官与相邻器官硒含量之间则没有相关关系，这可能是因为竹秆、竹枝、来鞭、去鞭仅作为硒元素运输的通道，而竹叶和竹根则为硒元素富集和转化的部位，在经过一段时间的硒元素富集和转化后，其硒元素浓度和相邻器官中硒元素浓度之间已不存在明显的相关关系。

3.3 富硒毛竹各器官硒的赋存形态

对富硒毛竹各器官中硒的赋存形态进行研究，结果显示，富硒毛竹各器官中硒赋存形态主要为有机形态硒，其中竹叶中有机硒含量最高达到97.29%，竹鞭中有机硒含量相对较低为94.46%（图1）。有机形态硒中蛋白结合态硒含量最高，其中竹叶中蛋白结合态硒平均含量为0.266 1mg·kg-1，占竹叶中有机态硒含量的87.19%，竹秆中蛋白结合态硒含量较低，平均值为0.049 2mg·kg-1，占竹秆中有机态硒含量的73.21%。竹叶中多糖态硒含量最高，平均可达0.025 9mg·kg-1，占竹叶中有机态硒含量的8.49%，各器官中核酸态硒含量极少，竹根中无机态硒含量最高，达0.014 4 mg·kg-1，占竹根全硒含量的5.04%。其他形态的硒可能主要为未提取完全的蛋白结合态硒或其他有机结合态硒。竹笋中有机形态硒含量为0.056 2 mg·kg-1，占全硒含量的94.85%，其中蛋白结合态硒含量为0.050 3mg·kg-1。

表2 不同年龄毛竹器官硒元素含量平均值及方差分析Table 2 Selenium contents in the organs of bamboo with different ages and variance component

表3 富硒毛竹各器官硒元素含量间的相关系数Table 3 The correlation coefficients of selenium content in selenium-enriched bamboo organs

图1 富硒毛竹各器官硒的赋存形态Fig.1 Selenium existing form in bamboo organs

4 结论与讨论

富硒毛竹各器官中总硒含量分布不平衡，表现为竹叶＞竹根＞去鞭＞竹篼＞来鞭＞竹秆＞竹枝＞竹笋，竹秆作为硒肥吸收和转运的重要器官，表现出较低浓度的硒含量，而于忠禾［10］等对灌浆期玉米植株中硒的含量研究表现为玉米叶片＞茎秆＞根系，这可能是因为玉米茎秆是营养物质重要的储存器官，而毛竹由于有庞大的地下茎系统作为营养物质的储存器官，竹秆在这方面的功能则相对较弱，从而也表现出较低浓度的硒元素聚集。竹叶和竹根中硒含量与其他器官的硒含量之间存在显著差异，表明硒元素有向新陈代谢旺盛的部位转运和累积的趋势，这与科研人员在其他植物中的研究相一致［10-14］。竹篼、竹鞭中硒含量表现为随年龄增加逐渐增加的趋势，这可能是因为随年龄增加，毛竹相关器官的输导能力减弱，一定程度上造成了硒元素的聚集。竹鞭与竹篼、竹秆与竹枝等相邻器官之间硒元素含量表现出显著的正相关关系，而新陈代谢旺盛的器官（竹叶、竹根）与相邻器官硒含量之间则没有相关关系，这可能是因为竹秆、竹枝、来鞭、去鞭仅作为硒元素运输的通道，在运输过程中，上一个输送器官中硒元素的浓度直接影响下一个输送器官中硒元素的浓度，而竹叶和竹根则为硒元素富集和转化的部位，在经过一段时间的硒元素富集和转化后，其硒元素浓度和相邻器官中硒元素浓度之间已不存在明显的相关关系。

富硒毛竹各器官中硒赋存形态主要为有机形态硒，其中竹叶中有机硒含量最高，竹鞭中有机硒含量相对较低。有机形态硒中蛋白结合态硒含量最高，多糖态、核酸态等其他有机形态硒含量则较少，这说明硒元素在毛竹体内主要与氨基酸和蛋白质结合并主要以氨基酸或蛋白质的形式在毛竹体内运输。竹笋中的硒含量与未富硒竹林竹笋硒含量相比提高188.51%，而竹林富硒施肥在2012年12月，竹笋取样在2013年4月，表明竹林富硒施肥4个月已表现出明显的富硒效果。竹笋作为竹林系统中重要亦是新陈代谢最旺盛的器官，其硒含量明显低于竹叶、竹根中的硒含量，这可能是一方面因为取样时间差异导致竹林对硒元素的吸收和富集强度不同造成，另一方面可能是竹笋生长速度快，竹笋中水分和营养物质的快速积累导致硒元素的浓度被降低。总之，本研究表明，通过竹腔注射的硒肥可被竹林很好地吸收和累积，表现为在生长旺盛的竹叶和竹根中含量较高，在其他器官中含量相对较低。

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