浓香型大曲中酶系与白酒品质的关系研究

2014-04-24王晓丹班世栋胥思霞王荣村沈锡翠邱树毅

中国酿造 2014年1期

王晓丹，班世栋，胥思霞，王荣村，沈锡翠，邱树毅*

（1.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州青酒集团有限责任公司，贵州镇远 557702；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025；4.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025）

大曲是酿酒中的糖化剂、发酵剂和生香剂，是发酵过程中一些酶产生的必需物，所以有“曲为酒之母”的说法。不同香型的白酒的用曲量是不同的[1]，浓香型大曲用量为20%左右，而酱香型白酒的用曲量可以达到85%～95%[2]，不同品质的大曲形成白酒香味成分也不同[3-6]，优质曲所酿造的酒中总酸、总酯和氨基酸的量比普通的大曲要多[7-9]。对于大曲来说，糖化力和液化力指标比较重要[10-12]，因为关系到原料的糖化结果，与酒的出酒率有直接关系，所以对于液化淀粉酶和糖化淀粉酶的研究较多，其他水解酶则对白酒的香味物质的生成或前体物质的生成有重要的贡献[13-16]。

研究了贵州某企业所生产的大曲中各种酶及酶活力与白酒品质的关系，为后续改良大曲的质量，提高酒品质和减少大曲用量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓香型大曲：贵州某企业提供。豆饼粉、麸皮：河南省台前县兴隆面粉有限公司提供。气相色谱所用试剂均为色谱纯，其他试剂和药品均为分析纯。

1.2 仪器及设备

UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司；6890N气相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 酸度的测定

称取5.0g绝干曲，置于250mL烧杯中。加水100mL，摇匀，于25℃浸泡30min，缓慢搅拌。经过滤，得滤液备用。取滤液10mL，于250mL三角瓶中，再加水20mL，滴1%酚酞指示剂2滴，0.1mol/L NaOH溶液滴定至微红色。酸度计算公式：

式中：C为NaOH溶液的摩尔浓度，mol/L；V为消耗NaOH溶液的体积，mL ；为100mL浸出液取10mL浸出液；10 5为5g曲换算成10g曲。

1.3.2 糖化力的测定

酶浸出液及糖化力测定试液制备：在250mL烧杯中加入蒸馏水90mL，再称取5.0g绝干曲粉加入烧杯中，在30℃条件下水浴1h，每隔15min搅拌一次，之后用定性滤纸过滤，最初的5mL滤液弃去，剩下的滤液4℃保藏。

在100mL容量瓶中吸取2%可溶性淀粉溶液50mL，35℃水浴20min，再加入10mL酶浸出液，摇匀后准确计时，反应1h后加入1mol/L的NaOH溶液3mL，待其停止反应，反应液至室温后用蒸馏水定容，此时的溶液为碱性。

空白试验液：在100mL容量瓶中吸取50mL 2%可溶性淀粉溶液，先加1mol/L NaOH溶液3mL，摇匀后加入10mL酶浸出液，之后用蒸馏水定容。

糖分测定：在250mL三角瓶中吸取5mL糖化液，再分别加入5mL费林氏甲、乙液，再加适量0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，之后在电炉上加热至沸，立即用标准葡萄糖溶液滴定，直到蓝色消失。滴定需要在1min内完成，滴定所消耗葡萄糖的体积为V1。

空白试验液的测定：用5mL的空白液代替糖化试液，其他操作与样品处理相同，葡萄糖消耗体积为V0。

糖化力的定义：1g绝干曲在35℃、pH4.6条件下反应1h，将可溶性淀粉分解后葡萄糖的质量（mg）数，U/g。糖化力计算公式：

式中：V0为5mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖液的体积，mL；V1为5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖液的体积，mL；ρ为标准葡萄糖溶液浓度，g/mL；为5g干曲浸出后在100mL溶液中取出10mL进行糖化试验；为100mL糖化液中取5mL定糖；1 000为换算系数。

1.3.3 液化力的测定

5%酶液的制备：取500mL烧杯，称取10g绝干曲粉加入其中，将200mL磷酸缓冲液（pH 6.0）在40℃条件下预热，然后加入烧杯中，并在水浴锅中保温1h，每隔15min搅拌1次，等浸泡时间结束后用定性滤纸过滤，最初的5mL滤液弃去，滤液即为供试酶液。

液化力的定义：1g绝干曲在60℃，1h液化可溶性淀粉的质量（g）。

液化力测定：用移液管取2%可溶性淀粉溶液20mL于25mm×200mm的具赛试管中，再加入5mL磷酸缓冲液（pH 6.0），在60℃条件下水浴10min，之后吸取1mL酶浸出液加入试管中摇匀，立即计时。在白瓷板中加入1.5mL稀碘液，每隔一定时间吸取0.5mL反应液于白磁板孔中，随着时间的延长，白瓷板中的颜色逐渐由蓝色变为红棕色，以最后一次呈蓝色为终点，样品做2个平行实验。最初取反应液的间隔时间可长些，当颜色接近终点时须仔细检查，至没有蓝色为反应终点。要求样品与酶液的反应在2～3min内完成为宜，否则需要调整酶液浓度后重新测定，酶液总体积以v表示，反应时间为t。液化力计算公式：

式中：20为2%可溶性淀粉溶液的体积，mL；60为时间换算系数；v为测定时所用酶液总体积（1mL）；t为反应时间（2min）。

1.3.4 酯化力的测定

酯化液制备：取0.1%己酸体积分数20%的乙醇溶液100mL于250mL蒸馏烧瓶中，称取5g干曲于烧瓶中，在32～35℃条件下酯化100h，之后再加入50mL蒸馏水，加热蒸馏，当蒸馏液为100mL时测定馏出液中己酸乙酯的含量。

酯含量测定：用移液管吸取馏出液50mL，之后用0.1mol/L NaOH中和至酚酞的终点，再吸取25mL 0.1mol/L NaOH溶液加入其中，沸水浴回流皂化30min，待其冷却后用0.05mol/L H2SO4滴定，当酚酞红色消失时为滴定终点。酯化力计算公式：

式中：C1、C2分别为NaOH和H2SO4的浓度，mol/L；V1、V2分别为NaOH和H2SO4标准溶液的体积，mL；m为干曲质量，g ；为从蒸馏液100mL中取出50mL测酯含量；144为己酸乙酯的换算系数。

1.3.5 蛋白水解力的测定

0.5 %干酪素溶液液的制备：称取干酪素0.5g（准确至0.000 1g）放入烧杯中，加水50mL，NaOH溶液10mL，搅拌均匀，加热至沸，溶解、冷却，加入酚酞指示剂3滴，滴加盐酸溶液中和至微红色消失（约8mL），加柠檬酸钠溶液7.5mL，移入1 000mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀；若隔日使用，加甲苯少许，放入冰箱中保存，以防微生物滋长。

5%样品溶液的制备：称取相当于5g绝干曲（称准至0.001g），移入100mL容量瓶中，摇匀，定容至刻度，在40℃水浴中，间断搅拌1h，过滤备用。

测定：取试管10支，按顺序编号，依照下表各试管规定量，分别加入0.5%干酪素溶液，5%样品溶液和蒸馏水，混匀。各试管同置于40℃水浴中，保温60min。取出各试管，分别加入硫酸镁硝酸溶液0.5mL，混合均匀，放入试管架上静置1h，观察各试管以不生成沉淀者为蛋白质分解已完全的标志，即生成沉淀的试管前的一个没有生成沉淀的试管为蛋白质刚好完全分解的临界值管，记录临界值管中5%样品溶液的体积a。蛋白分解力计算公式：

式中：0.5/100×5为干酪素溶液的稀释倍数；5/100为样品溶液的浓度，%；a为临界值试管中大曲浸出液的体积，mL。

1.3.6 白酒中各项指标的检测

按照GB/T10345—2007《白酒分析方法》进行。

2 结果与分析

2.1 酒质的测定

针对企业基酒酒质发生变化，尤其是酒体中乳酸乙酯含量升高，己酸乙酯含量下降，高级醇含量减少的现况。对全年酒质分析的结果表明（见表1），己酸乙酯与乳酸乙酯含量之比平均为0.65，主体香味不突出，酒体淡薄。

表1 酒体中己酸乙酯与乳酸乙酯的比值Table 1 Ratio of ethyl hexanoate and ethyl lactate in liquor

为了提高产率与产品质量，降低生产成本。对大曲的质量，进行检测，并针对其质量，采用酶制剂加以改良，从而达到保证质量、提高产量的目的。

2.2 大曲中糖化酶的产生及其与酒质的关系

白酒生产是以大曲为糖化发酵剂，名优酒大曲的糖化力往往在250～500mg/（g·h），而某企业生产的大曲糖化力一般均在750mg/（g·h）左右，且酸度较大。制曲前期的曲块中细菌和酵母的数量占优势，但是随着品温的升高，大量微生物的衰亡或生长受到抑制，数量急剧下降，这种生长优势发生改变。与细菌和酵母不同的是，在制曲前期，霉菌的生长速度比较缓慢，在培养5d后进入对数期，当培养8d后到达对数生长末期，以后进入稳定期，而其中大量的霉菌为根霉。根霉的糖化酶活力最高，除此而外还有黑曲霉和红曲霉也是糖化酶的产生菌。

根霉所产的酸主要有3种：即乳酸、延胡索酸和苹果酸。有些根霉只产乳酸，有些只产延胡索酸，有些不仅产乳酸而且还产延胡索酸而有些则这3种酸都产。但在以往的研究中发现只产延胡索酸和苹果酸的根霉对浓香型白酒的品质无明显的影响[17]。

在根霉的糖酵解途径中产生延胡索酸，在细菌或酵母代谢中，由延胡索酸酶催化为L-苹果酸，但随着苹果酸的大量累积，并在乳酸菌存在的条件下，会进行苹果酸-乳酸发酵，终产物中L-乳酸和CO2的含量较高，并含有少量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）和丙酮酸。

表2 不同糖化力的大曲试验结果Table 2 Experimental results of different diastatic power of Daqu

大曲中的根霉在提供了高的糖化力的同时也产生了大量的乳酸，造成大曲pH值下降，当发酵时乳酸和乙醇会发生酯化反应，生成乳酸乙酯，使得白酒中的含量增加。

以下是用不同糖化力的大曲生产试验，结果见表2。

由表2结果可知，糖化力高的大曲应用于生产，虽然出酒率略有升高，但由于乳酸乙酯含量过高，这使得酒体发闷，有强烈的青草味，从而影响了酒的品质。

2.3 大曲中蛋白酶的作用与影响

蛋白水解酶是催化多肽或蛋白质水解的酶的统称，简称蛋白酶。蛋白酶对机体的新陈代谢及生物调控起重要作用。蛋白酶可以将大分子的蛋白质降解为小分子的多肽或者更小的分子氨基酸等物质。如果在大曲中缺乏蛋白酶或者是酶活力较低，则对酒质的影响比较明显，造成酒体质量偏低。

在白酒中杂醇油含量主要与支链氨基酸有关，蛋白质分解成氨基酸再进一步水解放出氨、脱羧基，生成醇。除异丁醇和异戊醇外，还有戊醇、丙醇、异丙醇、庚醇等。酵母在代谢途径中能够产生脱氨和脱酸酶类，这些酶可以使苯丙氨酸转化成β-苯乙醇，色氨酸转化成色醇，酪氨酸转化成酪醇等。因此大曲中的蛋白酶含量的多少或者活力的高低，决定了蛋白质降解的程度，这也决定了高级醇含量的多少。

表3 窖泥中氨基酸含量与酒体中杂醇油、己酸乙酯含量关系Table 3 Relationship between amino acid content in pit soil and fusel oil,ethyl caproate content in liquor

氨基酸不仅与高级醇的生成有关，而且其含量与己酸乙酯生成的量呈正比，为考查窖泥中氨基酸含量与酒体中杂醇油、己酸乙酯含量关系，随机抽取9个样，结果见表3。

从表3结果可知，窖泥中氨基酸含量越高，酒体中的杂醇油和己酸乙酯含量也越高。一些可溶性氨基酸渗入窖泥内，为己酸菌繁殖生长提供了营养源，促进了己酸菌的发酵，从而产生更多的己酸。

据此原理可以推断，氨基酸含量的增加有利于酯的生成。

酒体中重要风味组份包括含硫有机物，比如二甲基硫、二甲基二硫的生成与半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的存在有关。即使含硫有机物的含量很少，可是由于其阈值极小，从而对白酒风味产生了一定的影响，特别是名优酒中含量较高。

表4 大曲中蛋白水解酶活力高低与酒质的关系Table 4 Relationship between proteolytic enzyme activity and liquor quality

大曲中蛋白水解活力不同对酒质产生较大的影响见表4。

表4结果表明，大曲中蛋白水解酶活性高，酒体中的高级醇、己酸乙酯含量高，酒体醇厚，主体香味突出。

2.4 大曲中酯化酶活力对酒质的影响

己酸乙酯含量的高低及与其他酯类物质（乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯等）的比例关系决定酒质的优劣，这是判定浓香型白酒酒质优劣的重要指标之一。根据酯化反应的原理，在生产浓香型白酒时，为提高白酒中己酸乙酯的含量，一般采用的是分离并筛选产己酸含量较高的菌株，在此基础上优化其培养工艺，提高在窖内的己酸含量。并且有时在改造窖池时，为稳定己酸的含量，在其中加入己酸菌液，以提高酒醅中己酸含量，从而达到提高酒体中己酸乙酯含量的目的。但酯化反应速度较慢，所以在有限的时间内，转化成酯的速率比较低。目前一般利用酯化酶催化技术，就是将己酸和乙醇用酯化酶催化生成己酸乙酯，使其含量明显升高。在形同的条件下，在大曲中加入2%酯化酶进行发酵实验，此时酯化酶的活力为236mg/（g·100h），其结果表明，实验窖中的己酸乙酯含量比对照窖中的要高，其分别是5.37g/L和3.26g/L（底糟），表明增加酯化酶能提高己酸乙酯含量。

酯化酶能够在水相中水解脂肪，可将酒醅中的脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸能够与乙醇酯化生成油酸乙酯、亚油酸乙酯和棕榈酸乙酯等高级脂肪酸，同时，在固态发酵条件下，酯化酶催化己酸、乳酸等小分子酸与乙醇作用，生成己酸乙酯、乳酸乙酯等风味物质，所以酯化酶的存在，对酒的风格的形成，起到举足轻重的作用。