氨基甲酸乙酯降解酶的基因克隆

沈敏佳，陆筑凤*，刘 颖，于建兴

（嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）又名脲烷，是发酵食品和酒精饮品在发酵或贮存过程中天然产生的污染物，曾作为医药和兽药使用，后因有毒且疗效欠佳而被禁止用于人类医药领域。2007年世界卫生组织（world health organization，WHO）认定氨基甲酸乙酯为2A级的多位点致癌物[1-2]，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病，并且乙醇对氨基甲酸乙酯的致癌性有促进作用[3-4]。氨基甲酸乙酯是食品发酵和贮藏过程中的天然产生物[5-6]，广泛存在于饮品酒类（葡萄酒、黄酒等）、酸乳酪、酱油等发酵制品中，不同食品中的含量不一，一般低于650μg/kg[7-9]。长期饮酒的消费者是氨基甲酸乙酯受害的高危人群[10-11]。目前食品中的氨基甲酸乙酯是继黄曲霉毒素之后的又一重要问题[12-14]。本实验以分子生物学方法鉴定氨基甲酸乙酯降解菌株菌种，构建氨基甲酸乙酯降解菌基因组文库，为研究分析氨基甲酸乙酯降解酶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与质粒

氨基甲酸乙酯降解菌1216：嘉兴黄酒厂土样中筛选获得；大肠杆菌菌株BL21：实验室保藏；大肠杆菌表达质粒pUC18：购自上海生工。

1.1.2 主要试剂和耗材

CTAB/NaCl溶液：5g十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶于100mL 0.5mol/L NaCl 中；TE缓冲液：pH 8.0，10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；20mg/mL蛋白酶K：购自上海生工；50mg/mL溶菌酶：购自上海生工；

上游引物27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

下游引物1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT

限制性内切酶BamH I和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒：购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Mbo I：购自大连宝生物有限公司。

筛选培养基（pH=6.5）：NH4NO30.5%，KH2PO40.2%，MnSO40.016%，MgSO40.13%，NaCl 0.3%，蛋白胨0.1%，葡萄糖1%，氨基甲酸乙酯0.5%，溴麝香草酚蓝（560mg/L）1%，琼脂2%。

技术创新 （inn）用每万人专利申请量表示。创新产出可以直观体现创新能力，而专利数量与创新产出具有较强的关联性，与专利申请量相比，专利授权量具有一定的滞后性，同时根据张玉明（2007）的研究，专利申请量与技术创新能力在空间分布上具有较好的匹配性［14］，因此选取专利申请量。

1.2 仪器与设备

VS-15000N高速离心机：韩国Vision公司；MG96+基因扩增仪、LG2020型凝胶成像系统：杭州朗基科学仪器有限公司；EPS-100电泳仪：上海天能科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 目的菌株基因组DNA的提取及过程优化

无菌水（或Tris-EDTA缓冲液）悬浮菌体与蛋白酶K和溶菌酶液混匀，于37℃温育2h。加入CTAB/NaCl溶液，混匀，于60℃温育10min。离心取上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混合液混匀，离心吸取上清液。加入0.6倍体积异丙醇，DNA沉淀，静置10min，离心取沉淀，悬浮于TE缓冲液，用1%琼脂糖凝胶电泳证实。

过程优化实验可适当延长37℃温育时间，使得细菌细胞充分裂解，提高DNA的得率。

1.3.2 基因组DNA的PCR扩增

以基因组DNA为模板，以27f、1492r为引物进行PCR扩增。PCR循环设定为：预变性94℃、10min；94℃、60s，53℃、60s，72℃、90s，共30个循环；72℃、10min；4℃，保存。PCR结束后，产物以1%的凝胶电泳进行鉴定，并按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒上的操作进行切胶回收。

1.3.3 PCR产物的测序

上一步的胶回收产物由上海上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果在GenBank上进行Blast比对，结合该菌形态学特征进行菌种鉴定。

（1）pUC18质粒的提取

用1mL 75%vol 乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次，去上清、干燥。加20μL TE缓冲液，使质粒DNA完全溶解，-20℃保存。质粒DNA用1%的琼脂糖电泳进行证实，并用切胶回收试剂盒对质粒DNA进行回收。

（2）酶切

Mbo I的识别序列为：GATC，BamH I的识别序列为：GGATCC。2种内切酶能够产生相同的粘性末端。用Mbo I对基因组DNA进行酶切，BamH I对pUC18进行酶切，酶切产物以1%的凝胶电泳鉴定，并用试剂盒进行切胶回收。回收产物基因组DNA与载体在T4 DNA连接酶的作用下形成重组载体，再转化入感受态细胞BL21，构建重组菌。

1.3.5 阳性重组载体的筛选

将适当体积采用上述方法转化后的感受态细胞涂布到含溴麝香草酚蓝的筛选培养基上，调至最佳变色pH，37℃孵育12～16h。直接从选择性平板上挑取四周明显变蓝色的菌落，加到0.5mL含氨基甲酸乙酯的Luria-Bertani（LB）培养液中37℃以120r/min摇育2h，平板放置4℃保存。抽提阳性重组菌的质粒，并用BamH I对抽提产物进行酶切，通过电泳结果近一步判断重组的质粒是否含有插入的预期片段。对目的片段进行切胶回收。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA

采用上述方法获取的基因组DNA，经1%的琼脂糖电泳证实，片段长度大于5 000bp，如图1所示，条带清晰，明亮。

图1 基因组DNA的凝胶电泳Fig.1 Gel electrophoresis of genomic DNA

2.2 PCR产物

以27f、1492r为引物扩增基因组DNA，得到的16S rDNA片段产物，长度约为1500bp。如图2所示。

图2 PCR产物（16S rDNA片段）凝胶电泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR product (16S rDNA)

2.3 菌种鉴定

16S rDNA PCR产物由上海生物工程有限公司进行测序（基因序列如图3所示），并通过在GenBank上进行Blast对序列进行比对分析。经过比对发现所扩增的1 500bp的DNA片段与基因库中腊样芽孢杆菌的基因序列呈99%同源。并且通过形态学鉴定可知氨基甲酸乙酯脱氨酶菌株的菌体细胞成杆状，末端方，成短或长链，（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，如图4所示。产芽胞，芽胞圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜，运动。在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落（似蜡烛样颜色）直径5～7mm。综上所述，可初步判定氨基甲酸乙酯降解酶菌株属于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

图3 16S rDNA基因序列Fig.3 Gene sequences of 16S rDNA

图4 固体培养菌落形态图Fig.4 Bacillus cereus colonial morphology

2.4 酶切产物

基因组DNA经限制性内切酶Mbo I酶切后的电泳图如图5所示，通过上述方法提取的pUC18质粒的琼脂糖电泳图如图6所示。

图5 基因组DNA酶切的凝胶电泳Fig.5 Gel electrophoresis of genomic DNA digested

图6 pUC18的凝胶电泳Fig.6 Gel electrophoresis of pUC18

2.5 阳性重组质粒筛选培养基的优化

图7 涂布有氨基甲酸乙酯降解酶菌株的筛选培养基(N2)和对照培养基(1)Fig.7 The screening medium with urethane degradation enzyme strains(N2)and control medium(1)

氨基甲酸乙酯降解酶能够使培养基中的EC脱氨产生NH4+，使培养基的pH值上升，而溴麝香草酚蓝的变色范围为6.0～7.2（黄-绿-蓝）。由于含有阳性重组质粒的大肠杆菌能够降解EC，涂布在含有1%（560mg/L）溴麝香草酚蓝的培养基上能够使培养基的颜色从黄色变为蓝色，而不含有重组质粒的大肠杆菌不能使培养基变色，所以可以通过颜色反应将阳性重组菌株筛选出来，如图7所示。

3 结论

实验经形态学和分子生物学方法鉴定氨基甲酸乙酯降解菌株1216为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），确定筛选培养基中加入1%（560mg/L）溴麝香草酚蓝，调pH至6.5（最佳变色pH）可有效筛选氨基甲酸乙酯降解菌。利用Mbo I限制性内切酶构建了蜡样芽孢杆菌1216的基因组文库，为后期筛选含有氨基甲酸乙酯降解酶基因的重组菌，研究分析该基因及酶的特性等奠定基础。

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