浓香型窖泥功能菌的培养工艺改进试验

杨爱华 ，刘 雪 ，2，张学梅 ，曹建全 ，2

（1.山东景芝酒业股份有限公司，山东景芝262119； 2.山东省酿造食品生物发酵技术重点实验室，山东景芝262119）

己酸菌是一类梭状芽孢杆菌，其代谢产物己酸是浓香型白酒主体香气物质己酸乙酯的前体物质，因此己酸菌在窖池内生长及产酸能力强弱将直接影响到白酒的品质。长期以来，如何提高以己酸菌为目的的有益窖泥功能微生物的数量，增强己酸菌代谢产生己酸的能力，一直是酒厂及科研单位探索和研究的方向。各酒厂分离得到的己酸菌产生能力不尽相同，一般为3～6 g/L[1]。如彭兵等[2]通过对从优质窖泥中分离获得的己酸菌发酵条件的优化，己酸产量为4.36 g/L；薛正楷等[3]筛选得到的己酸菌产己酸能力达到了5.47 g/L；本厂从优质老窖泥中筛选得到1株实验室产酸水平在6.5 g/L的己酸菌[4]。

影响己酸菌生长繁殖以及代谢产酸的因素较多，包括碳、氮、矿物质元素、水分、温度、酸度、乙醇浓度等，且在白酒酿造过程中，己酸菌主要以窖泥为生长繁殖的载体。而窖泥中除含有己酸菌之外，还存在大量的丁酸菌、甲烷菌、放线菌等共栖微生物[5]。近年来，己酸菌混合培养体系引起了广泛关注，利用微生物之间共栖性来推动己酸菌的发酵能力。陈翔等在己酸菌培养基中加入大曲粉、粉碎的酒醅，并将培养成熟的混合己酸菌液用于窖泥制作，取得了较好的效果；司波等[6]从己酸菌的生长特性出发，改善工艺条件，加入了窖泥、黄水和香醅，创造利于己酸菌生长和产酸且有效抑制杂菌生长的环境，提高了己酸菌培养液的质量及合格率；郭威等[7]筛选得到1株对己酸菌产酸有明显促进作用的优良放线菌；此外，己酸菌与丁酸菌[8]以及己酸菌与酵母混合培养都取得了很好的效果。

本研究从菌种复壮、大曲及窖泥处理方式和己酸菌与酵母混合培养等方面出发，改进窖泥功能菌液的培养工艺，增强己酸菌生长及产酸能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

己酸菌JZ-79、JZ-80由本厂优质老窖泥中分离得到；酵母菌由本实验室筛选并保藏；窖泥取自本厂优质老窖泥；大曲粉为本厂自制。

1.1.2 试剂

乙酸钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫化钠、乙醚、乙醇、琼脂粉、硫酸铜等，国药集团化学试剂有限公司；酵母膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3 培养基

磨口三角瓶、平底烧瓶及卡氏罐培养基：酵母膏5 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO40.2 g/L、K2HPO40.4 g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、NaAc 6 g/L,加蒸馏水定容至1 L，121℃下灭菌20 min；接种前加入无水乙醇2%、CaCO35 g/L。

1.2 仪器与设备

MLS-3751-PC高压蒸汽灭菌锅，日本松下公司；DHG型电热恒温鼓风干燥箱、DNP型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；5804R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；气相色谱仪，美国Agilent 7890A型气相色谱仪；色谱柱，CP-WAX 57CB毛细管色谱柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；厌氧发酵罐，山东泰山集团泰安市普瑞特机械制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 己酸菌的复壮

对所用己酸菌种包括JZ-79、JZ-80以及取自本厂窖池的优质老窖泥，进行复壮：85℃水浴加热10 min，按10%接种量接种于磨口三角瓶中，培养7 d后，测定各项发酵参数，包括细菌总数、硫酸铜显色，总酸、己酸、乙酸及丁酸含量，共进行4个轮次。

1.3.2 己酸菌的发酵罐培养

(1)己酸菌种子液的培养：将复壮后的己酸菌以体积分数10%的接种量接种到磨口三角瓶内，接种后三角瓶内装液量控制在90%以上，并对三角瓶封口。三角瓶内培养成熟的己酸菌按10%接种量接种于1 L的平底烧瓶内进行扩大培养，随后接入卡氏罐中培养成熟，作为种子使用。

(2)大曲及窖泥实验方法：研究不同窖泥及大曲处理方法对发酵结果的影响，不同接种量及窖泥、大曲处理方式见表1。

表1 大曲及窖泥处理方法设计

(3)己酸菌与酵母菌的混合培养

酵母菌种子液培养：从试管中接入经过培养基灭菌的小三角瓶，再以10%接种量接入大三角瓶，随后以10%接种量转入小型发酵罐中继续扩大培养，培养成熟，作为种子液使用。

己酸菌与酵母的混合培养：在发酵罐培养基中接入10%的按(1)方法培养的己酸菌种子液和2%上述培养方法得到的酵母菌种子液，混合培养，培养温度为35℃，时间为7 d。

1.3.3 菌体浓度测定

血球计数板计数：取5 mL适量培养液，以超纯水稀释适当倍数，用血球计数板计数富集菌液中的活菌数。

细菌总数计数：发酵结束后，采用上述血球计数板方法对发酵液中总菌数进行计数。

芽孢杆菌计数：发酵结束后的发酵液摇匀后取2 mL，加入8 mL无菌水中，80℃加热10 min，冷却后接入EAM培养基中，用封口膜封口，35℃培养24 h，再利用上述血球计数板法进行计数。

1.3.4 硫酸铜显色法[9]

吸取2 mL的培养液加入到试管中，加入2 mL 2%的CuSO4和1 mL乙醚，振荡摇匀后静置分层，观察乙醚层，呈现蓝色则说明有己酸生成。

1.3.5 气相色谱法测定发酵样品中的有机酸含量

色谱检测条件：CP-WAX 57CB毛细管色谱柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；检测器为氢火焰离子检测器；柱温采取程序升温，初始温度为35℃，保持3 min，然后以3.5℃/min的速率升温，升至180℃，再以15℃/min升至200℃，保持10 min；进样口温度为220℃，检测室温度为240℃；载气：(99.999%高纯氮气)流速为30 mL/min，氢气为30 mL/min，空气为350 mL/min；柱流速为0.8 mL/min，分流比35∶1,进样量为0.8 μL。

2 结果与分析

2.1 己酸菌的复壮

长期保藏以及重复使用的己酸菌菌种，其繁殖及产酸能力会有所下降，利用热处理的方法对其产酸能力进行复壮。菌株JZ-79、JZ-80由本厂分离筛选，利用甘油管法保藏于-80℃冰箱，窖泥为本厂优质老窖泥。对上述菌株采用80℃处理10 min，菌数变化如图1。热处理发酵7 d，JZ-79、JZ-80及窖泥1的菌数变化趋势一致，活菌数有所下降，特别对窖泥而言，热处理淘汰了大量的杂菌。连续热处理复壮，菌数基本保持不变。

图1 己酸菌复壮不同轮次菌数的变化趋势

经过两轮次复壮后，总菌数有所降低，但己酸产量明显增加(图2)。菌株JZ-79及优质老窖泥经复壮两轮己酸产量最高，分别为2909.7 mg/L和3113.1 mg/L，JZ-80复壮一轮己酸产量最高为3260.2 mg/L。可能是由于分离得到的菌种不同，芽孢的耐热能力各不相同，菌株达到最大产己酸能力需要经过复壮的轮次不同。

2.2 大曲不同处理方式对己酸菌发酵影响

由表2可知，将大曲粉进行加热处理，己酸产量为2762.7 mg/L，比未处理的2324.8 mg/L高了18.8%。大曲粉内除含有可提供己酸菌生长的营养物质外，还有大量的其他微生物，未经热处理的大曲粉，大曲内的微生物也将繁殖，导致大量杂菌的生长，而己酸菌的生长受到抑制，致使己酸产量受到影响。而热处理的方法淘汰了大量的杂菌。因此，在己酸菌培养过程中，可添加适量大曲粉，且大曲粉需在罐内经热处理，以提供己酸菌生长必需的营养物质，提高发酵过程中己酸菌浓度，再结合其他强化己酸合成的策略，从而提高己酸最终产量。

2.3 窖泥不同处理方式提高己酸产量

本轮实验探讨了己酸菌大罐培养基中添加的窖泥的处理方法对发酵的影响。结果如表3，发现以纯卡氏罐己酸菌种子接种以及纯窖泥接种时，己酸含量分别为2762.7 mg/L和2613.8 mg/L。当二者同时接种时，己酸含量为3029.5 mg/L，较单独接种分别提高了9.7%和15.9%。纯种培养的己酸菌，菌株强壮且产酸能力强，但己酸菌生长及产酸对培养条件要求较高。而窖池内环境非常复杂，在己酸菌培养过程中添加适量的窖泥，培养成熟窖泥中含有丰富的微生物及微量元素，对于促进己酸菌产酸及适应窖池内环境必不可少。同时发现，当窖泥经过加热处理之后再接种，己酸产量略有降低，为2934.6 mg/L，较未经过处理时仅降低了3.1%。但经热处理后，能够淘汰窖泥中大量的杂菌，且降低了发酵过程中的乙酸浓度，由3439.3 mg/L降低至3017.8 mg/L，降低了14.0%。

图2 己酸菌复壮不同轮次酸度的变化趋势

表2 大曲处理方法对发酵的影响

表3 窖泥不同处理方法对己酸发酵结果的影响

2.4 己酸菌与酵母混合培养提高己酸产量

复壮的菌株JZ-79、JZ-80以及热处理一轮的本厂优质老窖泥富集液，分别与酵母菌混合培养，并对以上3种菌进行混合培养。如图3所示，与酵母菌混合培养后，活菌总数增加，而芽孢杆菌数除优质老窖泥外，没有明显差异。与酵母菌混合培养后，JZ-79、JZ-80、优质老窖泥富集液和3种菌混合培养的总酸包括己酸、丁酸以及乙酸含量都有所提高(图4)，己酸含量分别由2795.9 mg/L、2930.4 mg/L、2110.5 mg/L和3067.5 m/L，提高至3204.3 mg/L、3439.3 mg/L、3025.7 mg/L和3365.6 mg/L；合成己酸的前体物质丁酸较原来也有明显提高，分别达到6431.8mg/L、6371.8mg/L、5557.0mg/L和6590.6mg/L。随后，在己酸菌培养基中提高酵母粉的添加量，己酸产量并未提高（数据未显示），因此，己酸产量提高的原因不是酵母给予己酸菌提供的营养物质。与酵母菌混合培养产酸提高的主要原因正如文献报道，可能是由于酵母菌的加入能够改善己酸菌生长的厌氧条件，从而强化了由乙酸到丁酸和由丁酸到己酸的代谢途径，进而提高了乙酸及丁酸的转化率[1]。

图3 己酸菌与酵母混合培养的菌数对比

图4 己酸菌与酵母混合培养的菌数有机酸含量对比

3 结论

本研究从菌种复壮、大曲及窖泥处理方式和己酸菌与酵母混合培养等方面出发，增强己酸菌生长及产酸能力：经热处理复壮的菌种，产酸能力明显提高，JZ-80复壮两轮、JZ-79和优质老窖泥富集液复壮一轮效果最好；经过热处理的大曲粉和窖泥，既有效促进己酸菌的生长及产酸，同时还能为己酸菌快速适应窖池内环境奠定一定的基础；酵母菌对己酸菌产己酸有较好的促进作用，且多种己酸菌混合培养产酸情况优于单一己酸菌培养。本研究通过不断探索和实验，己酸菌产酸能力有了很大的提升，为生产高质量的浓香型窖泥功能菌液提供了参考和依据。