己酸菌培养条件和不同微生物对己酸菌生长代谢影响的研究

刘英杰，张志伟，韩墨，杨平平，王燕

(齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353)

在窖泥中己酸菌数量的多少决定了窖泥功能的强弱，直接影响浓香型大曲酒质量的优劣。由于己酸菌的生存、生长、繁殖、代谢都有其自身的规律，只有不断地研究其规律，发现影响己酸菌生长繁殖代谢的主要因素，创造适宜己酸菌生长繁殖代谢的生态环境，才能提高窖泥中的己酸菌数量，从而为提高浓香型白酒质量奠定基础。

1 己酸菌的形态特征

1.1 己酸菌的菌落特征

笔者分离出1株己酸菌，菌落呈现乳白色圆形，周围有透明圈，菌落边缘不规则，见图1。

图1 己酸菌的形态特征

彭兵等[1]采用乙醇醋酸钠培养基对分离出的高产己酸菌株进行形态观察发现，菌落呈白色圆形、扁平、表面光滑，且菌落周围有较为明显的透明圈。侯小歌等[2]从白酒糟醅中分离出的己酸菌较大，圆形、透明、乳黄色。菌落呈现不同颜色可能是己酸菌来源不同，己酸菌的种群结构存在差异。

1.2 己酸菌的个体特征

己酸菌是生活在土壤中的棒状芽孢杆菌，长1.94～3.35 μm，宽0.51～0.75 μm，革兰氏染色阳性，适宜生活在pH为4.0～6.5的中性偏酸的环境中，游离孢子呈圆形，长0.15～0.18 μm。徐军等[3]从枝江老窖泥中分离出1株己酸菌，该菌体呈短杆状(0.6～0.7) μm×(3.5～4.5) μm，两头膨大成鼓槌状。与笔者从窖泥中分离出的己酸菌个体形态相同。

2 不同培养条件对己酸菌株数量、产酸的影响

2.1 碳源对己酸菌产酸的影响

己酸菌发酵所需的碳源主要来自于酵母发酵糖类产生的酒精和被其他微生物代谢生成的有机酸，所以维持酵母和霉菌等的适当营养，使之为己酸菌提供适量的乙醇和酸类等，则可以有效地促进己酸菌的生长代谢[4]。谢彪等[5]在乙酸钠培养基中分别添加2.5%的乙酸、淀粉水解糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳酸代替乙醇作为碳源，其他成分不变，相同条件下培养10天后，结果发现：用乙醇产己酸最多，可以达到20.3 g/L，葡萄糖产生的己酸量次之，为4.8 g/L。说明乙醇是己酸菌产己酸最好的碳源。

韩珍琼等[6]探究了乙醇浓度对己酸菌生长情况的关系，只改变培养液中乙醇浓度，33 ℃培养6天，观察己酸菌的个体形态发现：乙醇浓度在2%～3%范围内，菌数较多，生长良好；在其他范围内，己酸菌很少甚至没有，而且菌体也很小。说明适宜的乙醇浓度对己酸菌正常的生长至关重要。

在实际生产中，根据各地域的不同，调整一个合适的粮糟比，使入窖淀粉含量维持在15%～17%之间，其满足己酸菌和其他微生物所需的碳源[7]。

2.2 氮源对己酸菌株产己酸的影响

氮源是组成己酸菌细胞内蛋白质和核酸的重要元素，这2种物质又是微生物生命活动中不可缺少的物质，因此氮源对维持己酸菌自身的生长增殖非常重要[8]。

利用乙酸钠改良培养基，任静等[9]探究了L-亮氨酸和L-赖氨酸作氮源对己酸菌产己酸能力的影响，数据显示：上述2种氮源含量分别在0.2%和0.1%时产己酸最多；马业准[10]也探究了L-亮氨酸和L-赖氨酸作氮源对己酸菌产己酸能力的影响，结果显示：培养基中添加0.2%的L-亮氨酸或L-赖氨酸，己酸量增多。推测上述2种氨基酸有可能是除了起到氮源作用外，同时作为己酸菌的生长因子，促进了己酸菌产酸。

2.3 温度对己酸菌发酵的影响

己酸菌的营养细胞最适宜的生长温度在35 ℃左右。在适宜的温度范围内己酸菌可以被快速地激活、繁殖及代谢。温度过低会抑制生长代谢，过高则会导致早衰死亡。

谢彪等采用乙酸钠培养基，研究发酵温度对产酸的影响，控制温度为25，27，30，33，35，40，45 ℃发酵9天后，对发酵液进行己酸分析。结果表明：己酸产量随着温度的上升先增加后下降，发酵的最适温度为35 ℃，己酸产量达到19 g/L。

在浓香型大曲酒的发酵过程中要根据当地的气候，通过控制粮糟比、粮水比、量水温度、入池温度等工艺参数来控制发酵温度在29～36 ℃，为酿酒微生物提供一个适宜的生长代谢环境。

2.4 VC对己酸产量的影响

马荣山等[11]探究了VC对发酵液中的己酸产量的影响，实验表明：发酵液中添加VC会增加己酸的含量，原因是己酸菌在培养液里生长一段时间后，产生一定量的己酸，加入醇会酯化生成己酸乙酯；这时由于己酸不断产生，发酵液pH不断下降，适宜生长的环境条件遭到破坏，己酸菌进入了衰亡期。加入VC会抑制一部分己酸的酯化反应，延长对数期，从而对己酸生成有促进作用。

2.5 底锅水对己酸菌产酸的影响

谢国排[12]研究了底锅水对己酸菌产己酸的影响。当底锅水添加量从0～30%不断增加时，己酸产量也依次增加，最高达380 mg/dL，说明底锅水的加入确实促进了己酸菌的生长代谢。究其原因，是因为底锅水中含有部分有机质，在己酸菌的生长过程中为其提供营养；此外，有一部分有机质作为己酸菌生长代谢中的前驱物质促进了其代谢活动。该实验的不足之处在于未探究底锅水含量高于30%时对己酸菌产酸的影响，是否有可能己酸产量会更高。

2.6 CaCO3含量对己酸菌产酸的影响

谢彪等采用乙酸钠培养基，CaCO3添加量分别为0，5，10，15，20，25，30 g/L，其他成分不变，发酵10天后，对发酵液进行己酸含量测定。结果表明：CaCO3添加量在0～15 g/L范围内，己酸生成量逐步增加，在15～30 g/L范围内，己酸生成量逐步减少，比较得出培养基中CaCO3含量维持在15 g/L，己酸产量最高。

原因是碳酸钙中的钙离子不仅为己酸菌的代谢发酵提供了无机营养，调节和缓冲培养基的pH，而且对己酸合成有关的酶活性有一定促进作用。

3 其他微生物对己酸菌生长代谢的影响

3.1 乙酸菌对己酸菌生长代谢的影响

乙酸菌的主要功能是产生乙酸。由于乙酸是酸性较强的有机酸，在糟醅中会使环境的pH值降低，如果产生过量的乙酸，会对己酸菌的生长代谢环境造成影响，会抑制己酸菌的生长代谢过程，严重会造成浓香型白酒的酒质微量成分比例失调，质量下降。因此，在实际操作中一定要把糟醅的pH值控制在合适的范围内，并注意场地卫生，预防乙酸菌的过量繁殖，这对于乙醇的生成和己酸菌的生长都是有利的。

3.2 乳酸菌对己酸菌生长代谢的影响

乳酸菌是一个粗放型菌种，对环境要求不高，生长繁殖能力特别强，繁殖代谢速度快，世代生长周期比己酸菌短，因此，在白酒生产过程中稍有不慎，糟醅就会感染大量的乳酸菌，其发酵糖类产生大量乳酸，一方面使糟醅的pH值下降，阻止己酸菌的生长代谢，导致己酸菌和己酸乙酯的含量下降；另一方面，乳酸长期积累会与窖泥中的钙、铁离子结合生成乳酸钙、乳酸铁，己酸菌的生长繁殖受到抑制[13]。所以，在浓香型白酒生产过程中都要采取“增己降乳”的技术措施来提高浓香型白酒的质量。

3.3 甲烷菌对己酸菌的影响

己酸菌在生长和代谢中会产生对自身有毒害作用的H2和CO2，甲烷菌则利用氢作能源，CO2作碳源，消除己酸菌代谢的反馈抑制作用[14]。因此甲烷菌是己酸菌生活的合格环境清洁工，它的存在使窖内各种产 H2型发酵得以有效进行。实践证明：在人工老窖泥中，可以添加一定量的并具有良好共生作用的甲烷菌，使之成为窖泥中有益的功能菌，促进己酸菌的生长繁殖。

3.4 放线菌对己酸菌的影响

放线菌是一种固氮微生物，可以将分子氮转变为氨态氮，为己酸菌等微生物提供一定的氮源，实验表明：在己酸菌培养时，添加适量的放线菌对促进己酸菌活菌数的增长有显著的作用[15]。

4 结论与展望

己酸菌适宜培养条件：培养温度35 ℃，乙醇作碳源产己酸最多，pH值为5～7，酒精浓度2%～3%，CaCO3添加量15 g/L；培养基中添加VC、底锅水可以有效提高己酸产量；过量乳酸菌对己酸菌有抑制作用，浓香型白酒的生产中强调“增己降乳”，放线菌可为己酸菌生长提供氮源。掌握己酸菌适宜的生长环境，供给丰富、适当的营养，创造对己酸菌有益的微生物菌群，对己酸和己酸乙酯的形成大有裨益，进而为科研和生产提供理论指导，促进己酸菌的科学应用。

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