窖泥中己酸菌的筛选及其运用

谢圣凯，陈建新

（江南大学生物工程学院粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122）

浓香型白酒作为我国传统香型白酒之一，其具有窖香浓郁、香味协调等风格，己酸乙酯已被确定为其主体风味物质[1]。己酸乙酯主要由己酸和乙醇反应生成，其中，己酸产自窖泥中的己酸菌[2]，而首株己酸菌Clostridium kluyveri于1937年由巴克尔发现，其主要产生己酸和丁酸，同时还生成少量乙酸，该菌被视为己酸菌的模式菌株。目前已报道的己酸菌多属于专性厌氧的梭菌[3]，梭菌纲微生物分布较广，也一直被认为是影响窖泥质量的重要功能菌群[1]。

鉴于己酸菌对浓香型白酒发酵的重要性，众多学者对其展开研究。施安辉[4]从兰陵美酒厂窖泥中分离出己酸菌C1，其己酸产量基本保持在1.8 g/L以上。吴衍庸等[5]从泸州老窖窖泥中筛选出的泸酒梭菌己酸产量为3.08 g/L。薛正楷[6]从万宾酒业公司的百年窖池中筛选出的Clostridium celerecrescens菌株己酸产量为5.47 g/L。内蒙古轻工研究所分离到的己酸菌株内蒙古30#，其在35℃下培养10 d后的己酸产量达到7 g/L[7]。张彬等[8]报道的己酸菌S-20在神州八号飞船太空育种后，培养10 d的己酸产量为4.55 g/L。由此可见，窖泥中存在的多种己酸菌因其多样化的代谢产物从而具有较强的应用价值。

己酸菌广泛用于人工窖泥培养。姚万春等[9]以黄泥为载体培养的人工窖泥己酸菌数量为9.03×106cfu/g；天府酒业人工窖泥中己酸菌数量为5.4×105cfu/g[10]。

另外，鉴于浓香型白酒是在窖池中酿造，而窖池具有占地面积大、不利于控温发酵等缺点，目前已有一些酒厂采用生物反应器酿造浓香型白酒[11]。但是，窖泥以贴壁形式在反应器中使用，具有影响传热的问题；且黄泥载体窖泥黏附性强，不易取出，故需要培养出新型载体窖泥以适应生物反应器[12]。

本研究采用厌氧法从窖泥中分离高产己酸菌，并从pH值、乙醇耐受性、挥发性物质含量等方面研究其生理生化性质，另外结合16S rRNA性质分析其系统发育学地位。之后将本研究筛选的高产己酸菌作为己酸菌来源培养多种载体的人工窖泥，并搭配酒醅进行厌氧发酵以评估窖泥发酵性能，从而为浓香型白酒发酵及其生物反应器酿造提供优质菌株资源和适宜的窖泥。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料

窖泥a由某浓香型酒厂提供。

1.1.2 菌株来源

Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2均分离自窖泥a。

1.1.3 培养基

己酸菌分离与培养采用RCM培养基和ES培养基[1]。

1.2 仪器与试剂

气相色谱仪（GC2010），日本岛津公司；生化培养箱（BSP-250），上海博讯实业有限公司；厌氧产气袋、厌氧培养袋，日本三菱公司。

甲酸、己酸（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-乙基丁酸（色谱纯），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 己酸菌筛选[13]

把窖泥放入装有RCM液体培养基、装液量约90%的50 mL三角瓶中后，以80℃加热10 min，冷却后添加2%的无水乙醇，连同未涂布的RCM、ES固体平板快速放入厌氧培养袋中（内有氧气指示剂和厌氧产气袋，厌氧产气袋在耗尽氧气的同时会产生CO2），于37 ℃下培养4 d后，吸取200 μL窖泥培养液涂布RCM、ES固体平板，放入厌氧培养袋中，37℃培养至菌落长出，挑选平板上长出的单菌落在RCM平板上划线。

1.3.2 菌种鉴定

（1）基因组提取参考熊君燕的方法[14]。（2）PCR扩增，反应体系为 10×PCR buffer(Mg2+)5 μL，dNTP(2.5 mM）4 μL，DNA模板1 μL，10 μM 正反向引物（27F、1492R）各 3 μL，rTaq 酶(5 U/μL)：0.5 μL，ddH2O：33.5 μL。反应程序如下：预变性：94 ℃ 5 min；变性：94 ℃ 30 s；退火：56 ℃30 s；延伸：72℃ 1 min 30 s；后延伸：72℃ 10 min；循环数为30。PCR扩增纯化后进行测序，测序结果在NCBI中进行比对，上传序列后获取菌株登录号。

1.3.3 系统发育分析

将分离出的两株己酸菌16S rRNA序列与其亲缘关系最近的相关菌株的16S rRNA序列利用MEGA7软件中Clustal W功能进行比对。然后用Construct/Test Neighbor-Joining Tree方法构建系统发育树，数据进行1000次自展重抽样以确定各分支的准确性[1]。

1.3.4 挥发性物质采用气相色谱测定

液体样品处理：将5 mL样品在8000 r/min下离心10 min，通过滤膜后吸取562.5 μL滤液添加到含有31.5 μL 2-乙基丁酸[15]（184.8 g/L）、31.5 μL乙酸正戊酯（175.2 g/L）的25 mL容量瓶中，并用体积分数为1.5%[16]的甲酸溶液定容，混合均匀后吸取1 μL进行气相色谱测定。固体样品处理[17]：使用40 mL 60%乙醇溶液超声浸提5 g固体样1 h，将浸提液在8000 r/min下离心10 min，其余步骤同液体样品。

GC检测条件[16]：检测器：氢火焰离子化检测器；色谱柱：CB-FFAP（30 m×0.50 μm×0.32 mm）；温度程序：60℃保持5min，以25℃/min升至210℃，保持6 min；进样口温度为230℃；分流比：20∶1；检测器温度230 ℃。

1.3.5 己酸菌计数[14]

液体样品计数：取1 mL样品与9 mL无菌生理盐水混合，混匀后进行梯度稀释，选取稀释液涂布RCM平板，放入厌氧培养袋中于37℃进行培养。固体样品计数：取10 g样品于装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，低温振荡10 min，吸取1 mL样液与9 mL无菌生理盐水混合，其余操作与液体样品相同。

1.3.6 两株己酸菌培养实验

分别将150 μL的菌株Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2接种到装液量约90%[18]的RCM培养基中，培养适量时间后分别吸取150 μL菌液接种到相应培养条件的三角瓶中，快速放入厌氧培养袋中于37℃培养，培养结束后分别进行挥发性成分检测和己酸菌计数。

1.3.7 人工窖泥培养工艺流程[9]

己酸菌菌株→放大培养→添加窖泥种子、黄水、乙醇、大曲→复合功能菌液→加入黄泥等窖泥载体、窖泥种子、大曲、豆饼粉、乙醇、麸皮、乙酸钠、磷酸氢二钾、黄水、干酒糟、水→混合均匀→37℃下密封发酵60 d。

1.3.8 窖泥性能测定

实验室模拟发酵采用单粮发酵，其中，粮醅比为1∶4.5，粮曲比为3∶1，粮水比为1∶0.9，粮食∶稻壳为4.6∶1。将窖泥用人工窖泥袋包好后放在容器底部，添加一定比例的混蒸后加曲的酒醅，封口后快速放入厌氧培养袋中于37℃下培养50 d，之后取样检测酒醅中己酸、己酸乙酯等物质含量，以此评估窖泥性能。

2 结果与分析

2.1 己酸菌的筛选

2.1.1 己酸菌的筛选与鉴定

采用ES和RCM两种培养基分别筛选己酸菌，实验发现，涂布培养8 d后的ES固体平板无菌落长出，而RCM固体平板表面和底部皆有菌落长出。经过筛选纯化、分离鉴定和NCBI比对，使用RCM培养基从窖泥中筛选得到2株己酸菌见表1。

表1 窖泥中己酸菌的分离结果

2.1.2 菌株的形态

上述2株己酸菌的菌落和显微镜结构图见图1，两株己酸菌的菌落形态皆呈现凸起、白色、近圆形、光滑、质地均匀易挑起特征，显微形态上皆表现为杆状。

图1 己酸菌在培养基上菌落及微观形态比较

2.1.3 菌株厌氧性实验（表2）

由表2可知，此两株己酸菌皆属于严格厌氧菌，这符合梭菌纲细菌属于严格厌氧的芽孢杆菌类微生物的观点。

2.1.4 不同pH值培养条件下两株己酸菌培养液挥发性物质变化（图2）

表2 己酸菌株厌氧特征

图2 Clostridium guangxiense strain xsk1（a）、Clostridium kogasensis strain xsk2（b）发酵液中挥发性成分

由图2可知，Clostridium guangxiensestrain xsk1菌株在不同pH值条件下培养菌液中挥发性物质含量存在差异，其中，对比有机酸含量可知，己酸＜丁酸＜乙酸，这印证了丁酸、乙酸是合成己酸的前体物质的观点[19]，但是这也说明己酸菌在产酸方面可能并不是己酸含量最高。另外，在pH6时己酸、乙酸和丁酸含量皆处于最高，初步得出pH6较为适合该菌生长，这符合己酸菌更喜欢在中性偏酸性环境下繁殖的观点[18]。另外，其菌液中有检测到己酸乙酯和丁酸乙酯，而丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸、丁酸是浓香型白酒中重要的风味物质，这与胡晓龙筛选出的Clostridium kluyveriN6己酸菌液挥发性物质较为类似[1]。

同理，观察图2可知，Clostridium kogasensisstrain xsk2菌株在pH6时，菌液中己酸含量相比其他pH值条件下更高，且此时乙酸、丁酸含量也处于最高水平，说明该菌株在pH6条件下适宜生存。另外，此菌株菌液中也检测出丁酸乙酯和己酸乙酯，说明其对浓香型白酒风味物质的形成起到促进作用。

综上所述，上述两株己酸菌皆适宜在pH6条件下生长。

2.1.5 两株己酸菌株乙醇耐受性实验（图3）

由图3可知，在不添加乙醇时，Clostridium guangxiensestrain xsk1菌液中己酸含量相比添加乙醇己酸含量更高，这说明其在不含乙醇的环境下也可生长良好，从而证明了梭菌可利用底物的多样性，同时，丁酸和乙酸含量也呈现出类似现象，这与己酸的产生机制较为吻合[19]。另外，不添加乙醇与添加1%乙醇培养的菌液中己酸含量较为接近，这说明1%含量乙醇可能并未对该菌株产生较强胁迫，而适量乙醇也可为该己酸菌提供碳源物质[19]。值得注意的是，随着乙醇含量的增大，菌液中己酸、乙酸、丁酸含量皆逐渐降低，当乙醇含量增加到7%时，菌液中有机酸含量几乎不再变化，结合表3可知，这可能与该菌株在7%乙醇条件下培养4 d后几乎全部死亡有关。

Clostridium kogasensisstrain xsk2菌株在1%乙醇含量时己酸、乙酸和丁酸高于其他乙醇含量条件下菌液有机酸含量，可见1%乙醇含量为其适宜生长条件。结合表3可知，不添加乙醇时菌液中己酸菌数量高于添加1%乙醇时的菌液，而前者己酸含量却低于后者，这可能是己酸、丁酸含量过高抑制了己酸菌的生长[20]。

图3 Clostridium guangxiense strain xsk1（a）、Clostridium kogasensis strain xsk2（b）在不同乙醇含量下发酵液中挥发性成分变化

表3 不同乙醇添加量菌液中己酸菌数量

图4 两株己酸菌的16S rRNA基因序列的系统发育树

综上所述，可知两株己酸菌的乙醇耐受范围基本处于0%～5%之间。

2.1.6 两株己酸菌生理生化特征总结

如表4所示，两株己酸菌在许多性质上较为相似，这可能与其在窖池中经过长期驯化有关。

表4 两株己酸菌生理生化特性

表5 人工窖泥己酸菌数量检测结果

2.1.7 两株己酸菌系统发育分析

由图4可知，从窖泥a中筛选出的两株己酸菌分布于梭菌属，其与Clostridium kluyveri菌株遗传学地位相对较远，说明了己酸菌具有丰富的遗传多样性[21]。

2.2 己酸菌Clostridium guangxiense strain xsk1在人工窖泥培养中的运用

2.2.1 不同载体人工窖泥的培养

由表5可知，不同载体人工窖泥中己酸菌数量差异显著，其中，粉末活性炭载体人工窖泥＞黄泥、粉末活性炭和颗粒活性炭载体人工窖泥＞黄泥、粉末活性炭载体人工窖泥＞黄泥载体人工窖泥，而唯有粉末活性炭载体人工窖泥中的己酸菌数量超过窖泥a。虽然各载体人工窖泥己酸菌数量高低不同，但是仍需要进一步评估其发酵效果。

2.2.2 各载体人工窖泥的发酵性能

由图5可知，初始酒醅己酸含量几乎为零，厌氧发酵50 d后，各种窖泥发酵的酒醅中己酸含量几乎都高于不添加窖泥发酵的酒醅，这说明窖泥对于己酸的形成具有促进作用。按照5%比例添加的窖泥a发酵的酒醅己酸含量与不加窖泥发酵的酒醅较为接近，但是其明显低于按照10%、15%比例添加的窖泥a发酵的酒醅，且按照10%比例添加的窖泥a发酵的酒醅己酸含量略高于15%比例添加的窖泥a发酵的酒醅，这说明适量的窖泥搭配酒醅发酵效果可能会更好，而添加不同比例的黄泥载体人工窖泥的发酵酒醅的结果也证明了这点。另外，按5%、10%、15%比例添加的粉末活性炭载体人工窖泥发酵的酒醅，其己酸含量要略高或者显著高于其他3种载体的人工窖泥发酵的酒醅，但是，其更为接近窖泥a发酵酒醅的己酸含量。

对比酒醅中己酸乙酯含量可知，初始酒醅中己酸乙酯含量几乎为零，窖泥a发酵的酒醅己酸乙酯含量显著高于不添加窖泥的酒醅，且其明显高于其他各载体人工窖泥发酵的酒醅。其中，粉末活性炭载体人工窖泥发酵的酒醅己酸乙酯含量最为接近窖泥a发酵的酒醅。另外，可能由于酒醅发酵是在厌氧袋中进行的，过早的厌氧环境导致了酵母菌死亡过多，造成酒精产量较低，最终导致各载体人工窖泥相比不加窖泥发酵的酒醅己酸乙酯含量差异不大。

对比酒醅中乙酸含量可知，除去窖泥a，其他4种载体人工窖泥按照5%、10%比例发酵的酒醅中乙酸含量相差不大，且都显著低于按照15%比例添加的相应载体窖泥发酵的酒醅。而上述4种人工窖泥按照15%比例发酵的酒醅中乙酸含量与窖泥a按照10%、15%比例发酵的酒醅相差不大，但都显著高于不加窖泥发酵的酒醅。

对比酒醅中丁酸含量可知，随着培养时间的延长，酒醅中丁酸含量一般都高于发酵初始酒醅，其中15%比例添加的窖泥发酵的酒醅中丁酸含量一般都不低于5%、10%比例添加的窖泥发酵的酒醅，而且各载体人工窖泥发酵的酒醅与窖泥a发酵的酒醅丁酸含量相差不大。

综上所述，发现粉末活性炭载体人工窖泥的发酵性能更为接近窖泥a，考虑到其具有灵活的形状可塑性，在生物反应器中使用时容易取出，因此选定其作为适合生物反应器使用的新型窖泥。

图5 酒醅中挥发性物质含量

3 结论

己酸菌作为窖泥中的功能菌，其对合成己酸乙酯具有重要作用。本研究采用厌氧培养袋方法从窖泥中分离出两株己酸菌：Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2，菌株较适生长条件皆是pH6，乙醇耐受范围皆处于0%～5%之间。其厌氧培养10 d后，前者代谢产物为：己酸4.51 g/L、丁酸7.07 g/L、乙酸7.47 g/L、丁酸乙酯0.20 g/L、己酸乙酯0.13 g/L；后者代谢产物为：己酸2.5 g/L、丁酸1.6 g/L、乙酸2.36 g/L、丁酸乙酯0.09 g/L、己酸乙酯0.36 g/L，由此可见，上述两株己酸菌在浓香型白酒发酵上可能具有良好的运用前景[22]。另外，根据16S rRNA分析，上述两株己酸菌与模式菌株Clostridium kluyveri在遗传学性质上有显著不同，而且这两株己酸菌在发育地位上也相隔较远，从而说明己酸菌可能具有丰富的遗传多样性。

将高产己酸的Clostridium guangxiensestrain xsk1菌株作为己酸菌来源培养多种载体的人工窖泥，结果发现，培养60 d后的粉末活性炭载体人工窖泥中己酸菌数量为1.77×108cfu/g，黄泥载体人工窖泥己酸菌数量为1.18×105cfu/g，黄泥、粉末活性炭载体人工窖泥己酸菌数量为3.68×105cfu/g，黄泥、粉末活性炭和颗粒活性炭载体人工窖泥己酸菌数量达到2.08×106cfu/g。其中，粉末活性炭载体人工窖泥己酸菌数量高于窖泥a。之后，对比上述各载体人工窖泥和窖泥a的发酵效果发现，粉末活性炭载体人工窖泥发酵性能较为接近窖泥a。

综上所述，鉴于窖泥中微生物众多，本文只专注于窖泥中的己酸菌方面，这具有一定的局限性；而且，发酵后的酒醅中挥发性成分众多，而本文只检测少许物质，因此在后续实验中仍需要采用精密的检测仪器进一步完善。