款冬花和决明子中挥发性成分及抗氧化性质研究

何保江，屈 展*，曾世通，霍现宽，张文娟

（中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州 450001）

自然界植物合成和释放的低分子质量次生代谢物超过10万种，其中挥发性物质占很大比例[1]。植物挥发性成分大多有独特香味，具有杀菌、刺激、放松等效应，能使人适度兴奋、减缓疲劳及产生松弛感等，而且细胞内自由基产生的损伤可以导致癌症、心血管疾病和免疫系统衰退等多种退变性疾病，摄入外源性的抗氧化剂能有效地预防或抑制这些疾病的发生。提取植物挥发性成分不仅对香料、食品工业、日用化妆品工业和烟草工业的生产具有实用价值，而且对人类保健也有十分重要的意义[1]。另外，植物来源的天然抗氧化剂也受到越来越多的关注[2-3]。近年来，挥发性成分的抗氧化活性研究成为热点，如对迭迷香精油[4]、鼠尾草精油[5]、香菜精油[6]、仙人掌精油[7]、辛夷挥发油[8]等的研究。

款冬花为菊科植物款冬（Tussilago farfaraL.）的干燥花蕾，具润肺止咳、化痰平喘之功效[8-9]。决明子为豆科植物决明（Cassia obtusifoliaL.）或小决明（Cassia toraL.）的干燥成熟种子，异名为马蹄子，为临床常用中药。其性味甘、苦、咸，微寒。现代药理研究表明，决明子具有降血压[10]、降血脂[11]、保肝、通便、明目等作用[12]。目前国内对款冬花和决明子中挥发性成分的研究主要集中在挥发性成分的提取工艺及其成分分析等方面[13-14]，暂无对其中挥发性成分抗氧化活性的相关研究报道。本实验运用水蒸气蒸馏法提取2种中药的挥发性成分，通过可见分光光度法对其1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除能力及铁离子还原能力实验（ferric reducing ability of plasma，FRAP）值进行测定，并对影响其抗氧化活性的主要物质进行分析，从而探讨2种中药中挥发性成分的抗氧化性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验原料

款冬花和决明子均购于当地中药店。

1.1.2 主要试剂

没食子酸标准品、芦丁标准品、DPPH、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）、ABTS标准品购于国家标准物质中心。福林-肖卡试剂购于北京博奥星生物科技公司。无水乙醚、无水乙醇、95%vol乙醇、无水硫酸钠、硫酸亚铁、过硫酸钾、甲醇、盐酸均为分析纯。

1.2 实验仪器

1.3 实验方法

1.3.1 挥发性成分的提取

将干燥的款冬花和决明子粉碎，称取200g粉末，蒸馏水浸泡1.5h，进行水蒸气蒸馏6h，重蒸乙醚萃取，萃取液经无水硫酸钠干燥过夜，用旋转蒸发仪除去乙醚得黄色油状物，置于进样瓶中低温保存。

1.3.2 挥发性成分检测

GC-MS条件：MSDB-5（30m×0.25mm×0.25μm）毛细管气相色谱柱。程序升温：40℃（2min），3℃/min升至205℃（1min），再以20℃/min升至300℃（5min），恒流模式：He气，柱流速：1mL/min。MS条件：进样口290℃，离子源230℃，四级杆150℃，电子电离（electron ionization，EI）源。

挥发性成分检测：在最优条件下按照分流比（款冬花和决明子为5∶1）测定其挥发性成分。

1.3.3 挥发性成分中总多酚和总黄酮含量的测定

为了进一步探讨中草药中挥发性成分抗氧化活性的物质基础，对挥发性成分中总黄酮和总多酚的含量进行了测定，方法如下：

明确划分各级护理人员的职责以及工作标准,并将具体的职责层层分解具体到个人,术前完善器械以及仪器相关检查,术前1d集中访视患者,并于术日护理人员在手术室门口做好迎接、交接工作,根据手术内容护理做好相应的配合,术后常规管理,手术全程中需进行质量监控。

（1）总多酚含量的测定

标准曲线的制作：用移液管分别吸取0.0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL的0.5%没食子酸溶液，用水定容至100mL配制不同质量浓度的没食子酸标准溶液。从上述溶液中分别吸取1.0mL，加入水60mL、福林-肖卡显色剂5.0mL，混匀，然后在0.5～8.0min内各加入20%碳酸钠溶液15.0mL，定容至100mL摇匀。于20℃水浴保温2h后，在波长765nm处测定吸光度值。计算得到回归方程：y=0.000 9x-0.012 1（线性范围：0～500mg/L），相关系数R2=0.9981。

样品测定：吸取1.0mL稀释20倍的样品溶液，按前面介绍的方法测定吸光度值，计算总多酚含量。平行3次实验。

（2）总黄酮含量的测定

标准曲线的制作：精确称取105℃干燥的芦丁标准品0.021g，用30%体积分数乙醇溶液定容至100mL，备用。取7支具塞试管，分别加入0.0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL芦丁标准溶液，用30%体积分数乙醇补足至5mL，混匀，各加入0.3mL 5%NaNO2溶液，混匀静置5min，加0.3mL 10%Al（NO3）3溶液，混匀后静置6min，加入4mL 4%NaOH溶液，再加入0.4mL 30%体积分数乙醇使总体积为10mL，混匀静置10min，在波长510nm处测定吸光度值，以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标制作标准曲线，得到回归方程：y=0.0758x-0.0783（线性范围：0～0.063mg/mL），相关系数R2=0.999。

样品测定：分别吸取2种中药中的挥发性成分1.0mL按上述操作测定吸光度值，计算总黄酮含量，平行3次测定。

1.3.4 挥发性成分抗氧化能力的测定

（1）FRAP值测定

FRAP还原剂溶液的配制：称取0.3213g TPTZ，用40mmol/L 盐酸定容至50mL，则TPTZ 溶液的浓度为20mmol/L。向50mLTPTZ溶液中加入50mL浓度为20mmol/L的FeCl3·6H2O，再加入500mL浓度为0.3mol/L的醋酸盐缓冲溶液（pH3.6），混匀。

标准曲线的制作：称取0.145 6g FeSO4·7H2O，用甲醇定容至100mL，配制成浓度为2 000μmol/L的母液。用上述母液配制浓度为100～2 000μmol/L浓度的已知Fe（Ⅱ），即FeSO4·7H2O的甲醇液体（0、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L、1 200μmol/L、1 400μmol/L、1 600μmol/L、1 800μmol/L、2 000μmol/L）。各吸取0.3mL上述系列浓度液体，向其中加入9.0mL FRAP还原剂溶液和0.9mL蒸馏水在37℃条件下反应30min，在波长593nm处测定各吸光度值，以液体浓度为横坐标（x），以吸光度值（Y）为纵坐标建立标准曲线，并求得方程式：y=0.002 2x-0.057 6（R2=0.999 5）

样品的测定：取提取液0.3mL，按上述步骤进行操作，每一试样重复测定3次，从上述标准曲线计算相应的抗氧化浓度，样品的抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP单位相当于1μmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的μmol/L数。

（2）ABTS 自由基抑制剂活性测定法

ABTS+试剂的配制：将14mmol/L 的ABTS原液与4.9mmol/L过硫酸钾溶液按1∶1的体积比混合过夜，使用前用乙醇将混合液稀释至吸光度值A734nm为0.700±0.020。

样品的测定：向5.8mL的ABTS+试剂中加入0.2mL经20倍稀释的样品提取液，待充分混匀在30℃条件下避光反应5min，在波长734nm处测定吸光度值（Asample）；同时，5.8mL的ABTS+试剂与0.2mL乙醇在30℃条件下避光反应，在波长734nm处测定吸光度值（Acontrol）。抗氧化能力用ABTS清除率表示，计算公式：

（3）DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基溶液的配制：准确称取0.0780g DPPH，用95%vol乙醇定容于100mL棕色容量瓶中，获得浓度为0.2mmol/L的溶液[15-16]。

样品的测定取不同浓度的挥发性成分（0.02g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.1g/mL）各2mL，分别添加0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液各2mL，混合物用力振荡并室温避光反应30min，在波长517nm处测吸光度值（Ai），同时测定DPPH乙醇溶液2mL+乙醇2mL的吸光度值（Ao）和溶液2mL+乙醇2mL的吸光度值（Aj）。所有测定平行进行3次。计算公式[17]：

2 结果与分析

2.1 挥发性成分的成分分析

采用水蒸气蒸馏法提取2种中药中的挥发性成分，并且利用GC-MS分析挥发性成分的组成。款冬花中挥发油化学组分见图1、表1。经GC-MS测定，共检出57种化合物，主要包括1，2，4A，5，6，8A-六氢-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）--酮（15.65%），1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）3环「2，2，1，0（2，6）」庚烷（13.46%），2，4，5，6，7，8-六氢-3，5，5，9-三甲基-1H-酮（8.42%）和1-乙氧基丙烷（8.02%）。

图1 款冬花挥发性成分的GC-MS图谱Fig.1 GC-MS chromatograms of Tussilago farara volatile component

表1 款冬花挥发性成分分析Table 1 The volatile components of Tussilago farara

决明子中挥发油化学组分结果见图2、表2。经过GC-MS测定，共检出28种化合物，其中主要包括2，4A，5，6，8A-六氢-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘（13.51%），1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三环「2，2，1，0（2，6）」庚烷（11.88%）和2，4，5，6，7，8-六氢-3，5，5，9-甲基-1H-酮（8.28%）。吕华军等[14]采用超临界二氧化碳萃取决明子中挥发油，共得到51种化合物。可能由于采用的萃取手段不同。

图2 决明子挥发性成分的GC-MS图谱Fig.2 GC-MS chromatograms of Cassia obtusigolia L.volatile component

2.2 挥发性成分的抗氧化实验结果

2种中药的FRAP值见表3。由表3可知，款冬花挥发性成分的FRAP值较大，其抗氧化能力较大；决明子挥发性成分的FRAP值较小，也具有一定程度的抗氧化性。

表3 两种中药挥发性成分的抗氧化性Table 3 The ABTS,DPPH,TPC,TFC and FRAP values of two Chinese medicine

2种中草药挥发性成分对ABTS+自由基也有一定的清除能力，款冬花挥发性成分的清除率较大，抗氧化性较强，决明子的ABTS清除率相对较小，抗氧化能力较弱。

由表3可知，2种中草药挥发性成分对DPPH自由基有一定的清除能力，决明子对DPPH自由基清除率较小，而款冬花对DPPH自由基清除率较大。不同中草药挥发性成分对DPPH自由基清除能力相比，款冬花的抗氧化性较强，决明子的抗氧化能力较小。

2.3 挥发性成分总酚和总黄酮测定结果

从表3可知，决明子总酚含量为（70.1±6.2）μg/mg，总黄酮含量为（27.71±1.96）μg/mg；款冬花总酚含量为（83.4±9.89）μg/mg，总黄酮含量为（48.54±1.75）μg/mg。从这些可以说明，2种中草药挥发性成分的抗氧化性可能来自含量较高的总酚和总黄酮，江慎华等[18]对丁香的抗氧化活性进行研究时，也发现其主要的抗氧化活性物质基础由总多酚和总黄酮所贡献。由此可见，2种中草药中挥发性成分的抗氧化活性可能主要来自总多酚和总黄酮的假设得到了进一步的验证。

3 结论

本实验通过水蒸气蒸馏法分别提取了2种中草药中的挥发性成分，并分析了挥发性成分的主要成分，同时分别通过测定挥发性成分对DPPH自由基清除能力、FRAP值、ABTS+自由基抑制活性，说明款冬花和决明子挥发性成分具有不同程度抗氧化能力，而且通过测定挥发性成分总多酚和总黄酮含量，说明挥发性成分抗氧化活性可能主要来自总多酚和总黄酮。

[1]邓晓军，陈晓亚，杜家纬.植物挥发性物质及其代谢工程[J].植物生理与分子生物学学报，2004，30（1）：11-18.

[2]MACIEL M V,MORAIS S M,BEVILAQUA C M L,et al.Chemical composition ofEucalyptusspp.essential oils and their insecticidal effects onLutzomyia longipalpis[J].Vet Parasitol,2010,167(1):1-7.

[3]郑 华，李文彬，金幼菊，等.植物气味物质及其对人体作用的研究概况[J].北方园艺，2007（6）：76-78.

[4]许鹏翔，贾卫民，毕良武，等.不同产地的迷迭香精油成分分析及品质研究[J].分析科学学报，2003，19（4）：361-363.

[5]区敏港，彭新宇，唐兴刚，等.黑胡椒、快乐鼠尾草与生姜精油的化学成分及其对产气荚膜梭菌的抑制活性[J].畜牧与兽医，2012，44（3）：62-65.

[6]陆占国，郭红转，封 丹，等.香菜茎叶精油的提取及其成分解析[J].中国调味品，2007（2）：42-46.

[7]汪凯莎，丁丽娜，刘建华，等.仙人掌超微粉挥发性成分研究[J].生物技术，2009，19（5）：54-55.

[8]魏鹏程，赵铭钦，刘鹏飞，等.不同蒸馏方法提取辛夷挥发油的比较研究[J].现代食品科技，2013，29（2）：358-361.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005.

[10]刘晓冬，卫永第，安占元，等.中药款冬花挥发性成分成分分析[J].白求恩医科大学学报，1996，22（1）：33.

[11]刘菊秀，苗 戎，狄俊荚，等.决明子降压作用的实验研究[J].天津中药，1990，4（5）：37.

[12]张家雄.决明子降脂有效成分的研究[D].成都：成都中医药大学硕士论文，2005.

[13]何菊英，刘松青.决明子的药理作用及其临床应用[J].药学实验杂志，2001，19（2）：111-113.

[14]LIU Y F,YANG X W,WU B.Chemical constituents of the flower buds ofTussilago farfara[J].J Chinese PharmSci,2007(16):288-293.

[15]吕华军，黄举鹏，卢 建，等.决明子挥发油成分的GC-MS 分析[J].中国现代中药，2008，10（6）：23-25.

[16]BENZIE I F F,STRAIN J J.The ferric reducing ability of plasma as a measure of“antioxidant power”:the FRAP assay[J].Anal Biochem,1996,239(1):70-76.

[17]LISSI E A,MODAK B,TORRES R,et al.Total antioxidant potential of resinous exudates fromHeliotropiumspecies,and a comparison of the ABTS and DPPH methods[J].Free Radical Res,1999,30(6):471-477.

[18]YEN W J,CHANG L W,LEE C P.Inhibition of lipid peroxidation and nonlipid oxidative damage by carnosine[J].J Am Oil Chem Soc,2002,79(4):329-333.

[19]江慎华，王书源，马海乐，等.丁香活性物质的提取工艺及其抗氧化活性研究[J].农业机械学报，2010，41（1）：132-138.