Her2阳性乳癌组织TopⅡα的表达及临床意义

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(青岛大学附属医院乳腺病诊疗中心，山东 青岛 266101)

随着分子生物学研究的不断深入，人们发现乳癌是一种多基因变异所致的高度异质性疾病。人表皮因子受体基因2(Her2)是目前研究最多且机制最清楚的乳癌相关基因之一，Her2/neu阳性被认为是影响乳癌预后的独立因素[1]。DNA拓扑异构酶Ⅱα(TopⅡα) 基因位置与Her2基因毗邻，其编码的蛋白分子存在于增殖细胞中。近期的研究结果表明，TopⅡα基因的扩增几乎全部伴随着Her2/neu基因的扩增，但在TopⅡα蛋白研究方面并未见相似情况发生[2]。TopⅡα基因亦与乳癌预后密切相关，而TopⅡα蛋白表达能够指导蒽环类药物的给药剂量。既往有研究显示，TopⅡα蛋白表达与其基因扩增缺乏相关性，可表现为TopⅡα基因不扩增，而蛋白质表达过量[3]，二者虽然都是预测化疗药物疗效的标记物，但目前并不清楚两者中哪一个更重要，且是否有必要同时检测。本研究选取Her2阳性的乳房浸润性导管癌(简称乳癌)组织56例，分析TopⅡα蛋白的表达量与TopⅡα基因状态的关系及二者与乳癌临床病理特征之间的关系，旨在评估TopⅡα与乳癌恶性程度的关系，为判断乳癌预后和制定个体化的治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取我院乳腺病诊疗中心组织标本库中2013年1—6月Her2阳性乳癌标本76例，均为女性病人，年龄29～69岁，中位年龄49岁。病人术前均未行化疗、放疗和内分泌治疗。所有标本均经荧光原位杂交(FISH)技术检测确定为Her2阳性。

1.2 实验方法

1.2.1免疫组化(IHC)技术检测TopⅡα蛋白的表达 采用IHC技术检测TopⅡα蛋白的表达。具体步骤按照试剂盒说明书进行。单克隆抗体蛋白TopⅡα抗体(1∶100稀释)由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。每个肿瘤样本分别计数500个肿瘤细胞的TopⅡα蛋白阳性表达百分比。阳性信号定位于细胞核，肿瘤细胞核呈棕黄或棕褐色的细胞数<25%定为TopⅡα蛋白Ⅰ级，以25%～50%为Ⅱ级，51%～75%为Ⅲ级，>75%为Ⅳ级。

1.2.2FISH技术检测TopⅡα基因的表达 杂交所用的4 μm厚的石蜡组织切片取材于已确定行IHC检测的标本组织。PathVysion DNA LSITOPⅡΑ/CEP17探针试剂盒购自上海Vysis公司。具体步骤按照试剂盒说明书进行。荧光显微镜下分别读取经DAPI染色细胞的绿色、橙色荧光信号，在triple-band-pass滤片下同时观察3种荧光信号。图片的获取由FISH 3.0进展成像软件的照相机拍摄。分别记录每个细胞中TopⅡα基因拷贝数(红色荧光)和17号染色体着丝粒(绿色荧光)数目，每个样本记录60个肿瘤细胞。TopⅡα基因变异率为TopⅡα基因探针信号数目(红色)与17号染色体信号(橙色)数目的比值。当比值>2.0，TopⅡα基因为扩增；比值<0.8，为TopⅡα基因缺失；比值0.8～2.0，为TopⅡα基因无变化。

2 结 果

2.1 TopⅡα基因变异与蛋白表达的关系

在25例(32.89%)TopⅡα基因扩增或缺失者中，TopⅡα蛋白Ⅰ级者11例(44.00%)，Ⅱ级者8例(32.00%)，Ⅲ级者6例(24.00%)；在51例(67.11%)TopⅡα基因无变化者中，TopⅡα蛋白Ⅰ级者16例(31.37%)，Ⅱ级者18例(35.29%)，Ⅲ级者17例(33.33%)。TopⅡα基因变异与TopⅡα蛋白表达无显著相关性(P>0.05)。

2.2 TopⅡα蛋白表达和基因变异与乳癌临床病理特征的关系

TopⅡα蛋白表达和基因变异与病人年龄、绝经情况、组织学分级及AJCC分期无显著相关性(P>0.05)，而与病人有无腋窝淋巴结转移则显著相关(χ2=8.546、7.285,P<0.05)。

3 讨 论

TopⅡα基因是与Her2/neu基因相邻的编码基因，定位于染色体17q21-22，存在于增殖细胞，主要分布于核的基质中。TopⅡα蛋白是一种作用于DNA特定区域而参与DNA转录、复制、修复的酶。DURBECQ等[4]的研究结果表明，TopⅡα酶蛋白过表达37%发生在Her2基因扩增病人，38%发生在Her2/neu基因未扩增的晚期乳癌病人；研究结果显示，在Her2/neu阳性的乳癌病人中，35%的病人发生TopⅡα基因扩增，且这些病人从含蒽环的药物方案治疗中显著获益。由此可见，TopⅡα基因扩增与Her2/neu的表达关系密切。大量研究认为，TopⅡα蛋白的表达量与TopⅡα基因水平缺乏相关性[3]。本研究结果显示，在TopⅡα基因变异(扩增或缺失)与无变化组中，都观察到TopⅡα蛋白的表达，但在TopⅡα基因变异组中，TopⅡα蛋白高表达率为56.00%(TopⅡα蛋白Ⅱ、Ⅲ级)，低表达率为44.00%(TopⅡα蛋白Ⅰ级)，两者差别较小。但也有研究报道，TopⅡα蛋白的表达和TopⅡα基因扩增有相关性[5]。这可能是样本量及检测方法的差异所致，除了转录后调节之外，可能还有其他的原因造成了蛋白的过表达[6-7]。

表1 TopⅡα基因变异与蛋白表达的关系(例)

表2 TopⅡα基因及其蛋白与乳癌临床病理特征关系(例)

乳癌的临床病理特征是制定乳癌治疗方案的重要临床指标。有研究显示，TopⅡα蛋白的表达与肿瘤大小无关，而与有无区域淋巴结转移有关，表明TopⅡα蛋白的表达可能与肿瘤的生物学行为相关，可能是乳癌恶性程度增高的指标[8]。本研究结果显示，TopⅡα蛋白的表达与病人的年龄、绝经情况、组织学分级及AJCC分期无关，而与有无腋窝淋巴结转移相关，TopⅡα基因的变异也只与有无区域淋巴结转移有关。目前，Her2已被公认与乳癌的发生、发展及其恶性程度的关系密切，为乳癌独立的预后因素，该基因在20%～30%的乳癌组织中扩增与过表达[9]。而TopⅡα基因位于人类染色体17q12-21上，与Her2基因毗邻，TopⅡα基因扩增常见于Her2基因扩增的病例中。BCIRG005临床实验选择了1 600例Her2阴性的乳癌病例，发现所有病人中无1例伴有TopⅡα的扩增，提示TopⅡα的扩增仅仅局限在Her2过表达病例中。而另有研究显示，35% Her2/neu阳性的乳癌病人发生TopⅡα基因扩增，且这些病人从含蒽环类药物的化疗方案中显著获益[4]。大量研究也已证实，TopⅡα蛋白和基因都是预测蒽环类药物化疗效果的重要临床指标。

在临床上应用IHC法检测蛋白的表达比应用FISH法检测基因更为经济，且应用更为广泛，故对TopⅡα蛋白的检测更具有临床价值。本研究选取Her2阳性的乳癌组织，排除了Her2对TopⅡα的影响，但也存在缺陷，没有分析TopⅡα基因倍体性与临床病理特征的关系，且样本数量较少，实验结果尚待大样本实验研究进一步证实。

[参考文献]

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[3] SCHINDLBECK C, MAYR D, OLIVIER C, et al. Topoisomerase Ⅱ alpha expression rather than gene amplification predicts responsiveness of adjuvant anthracycline-based chemotherapy in women with primary breast cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010,136(7):1029-1037.

[4] DURBECQ V, PAESMANS M, CARDOSO F, et al. Topoisomerase-Ⅱ alpha expression as a predictive marker in apopulation of advanced breast cancer patients randomly treated either with single-agent doxorubicin or single-agent docetaxel[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2004,3:1207-1214

[5] MENG H, CHEN R, LI W, et al. Correlations of TOP2α gene aberrations and expression of topoisomerase Ⅱα protein and TOP2α mRNA expression in primary breast cancer: a retrospective study of 86 cases using fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry[J]. Pathol Int, 2012,62(6):391-399.

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[8] 徐光辉,叶胜龙,郑义同,等. 人乳腺癌中3种耐药基因产物的表达及其与预后的相关性[J]. 复旦学报:医学版, 2005,32(1):33-35,39-128.

[9] SIDDIQA A, LONG L M, LI L, et al. Expression of HER-2 in MCF-7 breast cancer cells modulates anti-apoptotic proteins Survivin and Bcl-2 via the extracellular signal-related kinase (ERK) and phosphoinositide-3 kinase (PI3K) signalling pathways[J]. BMC Cancer, 2008,8(8):129.