携带IL-18基因人脐带间充质干细胞的构建

王琳，李福年，柳晓义，姜丹丹，吕志栋，曲慧利

(青岛大学医学院附属医院乳腺外科，山东 青岛 266003)

基因治疗是治愈肿瘤的重要举措之一，大量基础研究已取得许多重要成果并显示出良好的应用前景，但如何找到高效性、特异性、靶向性的治疗基因载体一直是基础与临床研究的热点。近年来研究显示，骨髓源性间充质干细胞(MSCs)对肿瘤组织具有趋化特性，能被转染表达外源基因，同时保持自身生物学稳定性，是一高靶向性基因治疗的有效运载工具[1-2]。因骨髓源性MSCs数量有限，增生、分化能力随着年龄增长而明显下降，限制了其广泛应用。相对于骨髓源性MSCs，人脐带MSCs(hUMSCs)则无上述缺憾。IL-18是新发现的细胞因子，能通过多种途径发挥抗肿瘤作用[3]。本文拟从人脐带组织分离hUMSCs，将携带IL-18基因的慢病毒转染该细胞，制备一种能稳定表达IL-18的hUMSCs，为乳癌基因治疗提供一种有效的实验工具。

1 材料和方法

1.1 标本和试剂

脐带取自我院产科健康剖宫产产妇，经产妇及家属授权同意；携带IL-18基因的慢病毒和携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司构建；RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；兔抗人IL-18抗体(ab68435)购自美国Abcam公司；抗GAPDH抗体及HRP标记的IgG购自北京康为世纪生物科技公司；小鼠抗人PE或FITC标记的单抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD105购自美国Invitrogen公司；RPMI 1640及DMEM低糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)等购自美国HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1hUMSCs的体外分离、培养方法和形态学观察 无菌采集足月健康胎儿脐带4～5 cm，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复充分洗涤，用注射器冲去脐静脉及动脉内的残留血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，即可获得脐带Wharton胶组织，将其剪碎成1～2 mm3组织块，移至质量分数为0.001的胶原酶Ⅳ中，37 ℃消化18 h，定时摇动，过100目筛网，收集含细胞的滤液，室温下以1 200 r/min离心10 min，弃上清液，保留沉淀；用PBS洗涤2次后，以1×109/L的细胞密度接种于T25塑料培养瓶中，置37 ℃、含体积分数0.05 CO2的饱和湿度环境下，于含体积分数为0.10 FBS的DMEM-LG中培养。6～7 d后首次全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4 d换液1次。观察细胞达80%融合后，用胰酶消化1～5 min，在显微镜下控制消化时间，按1∶3的比例传代培养。取生长良好的第3代hUMSCs用于实验。

1.2.2hUMSCs表面标志的检测 第3代细胞长到90%融合时，胰酶37 ℃消化1～5 min，调整细胞密度至(1～2)×109/L，使用PBS洗涤3次，加入1 mL预冷的体积分数为0.70的乙醇，充分吹打制成单细胞悬液，4 ℃冰箱中固定24 h后，离心，弃去上清液，分别加入小鼠抗人PE或FITC标记的单抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD105及同型对照，室温避光孵育30 min，PBS洗涤后用多聚甲醛重悬，流式细胞仪分析。

1.2.3携带IL-18基因的慢病毒转染hUMSCs 将hUMSCs细胞按每孔1×104接种于96孔培养板中，每孔加100 μL培养基。12～20 h后感染病毒，根据感染复数(MOI)加入相应量的病毒。加polybrene，24 h后换培养液。共设3个组：实验组转染慢病毒，对照组转染空白慢病毒，空白对照组未进行转染。转染72 h后荧光显微镜下观察各组绿色荧光蛋白的表达，分析感染效率，选择最佳感染条件。

1.2.4RT-PCR法检测IL-18-hUMSCs的mRNA表达 转染5 d后采用Trizol试剂提取3组细胞总RNA，IL-18基因上游引物序列为：5′-GAATAAAG-ATGGCTGCTGAACC-3′，下游引物为：5′-CCTGG-GACACTTCTCTGAAA-3′，扩增片段长439 bp；以GAPDH作为内参照，扩增片段长146 bp。进行RT-PCR反应，反应条件：95 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35个循环。取扩增后产物于20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳分析，与对照组和空白对照组进行比较。

1.2.5Western方法检测IL-18-hUMSCs的蛋白表达情况 每组收集1×106个细胞，裂解后离心，上清液作为样本，95 ℃水浴变性10 min，离心，取上清液，-20 ℃冰箱保存。进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜。封闭后加入兔抗人IL-18抗体(Abcam，1∶1 000)及抗GAPDH抗体，4 ℃反应过夜。第2天洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(北京康为世纪公司生产，1∶8 000)，室温孵育1 h，化学发光法检测目的蛋白质的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 hUMSCs分离培养和鉴定

体外分离的hUMSCs贴壁生长，呈长梭形，以分散的克隆集落形式增殖(图1a)。携带IL-18基因慢病毒表达载体稳定转染后，hUMSCs细胞形态未见明显变化，仍为长梭形(图1b、c)。流式细胞仪检测结果显示，CD29、CD44和CD105为(+)，CD34和CD45为(-)，符合hUMSCs的表型(图2)。

2.2 转染IL-18的hUMSCs的鉴定

感染时将病毒按不同MOI值加入hUMSCs细胞中。结果显示，hUMSCs细胞在MOI为70、50、30、10时的感染率分别为95%、80%、55%、25%(图3)。MOI值越高，绿色荧光强度越强，MOI为50、30、10时均未见明显的细胞毒性，但MOI为70时hUMSCs细胞形态欠佳。因此，本研究确定最佳感染条件MOI为50。

2.3 IL-18 mRNA的表达

以GAPDH(长为142 bp)为内参照，实验组在435 bp处可见一特异性条带，其IL-18 mRNA的相对表达量为1.38±0.34；而对照组和空白对照组则未见此条带，其IL-18 mRNA的相对表达量分别为0.48±0.18、0.73±0.29。两对照组间IL-18 mRNA相对表达量比较差异无显著性(P>0.05)；与两对照组比较，实验组IL-18 mRNA相对表达量明显增高，差异有显著性(F=27.54，P<0.05)。见图4。

2.4 IL-18蛋白表达情况

在转染后5 d，实验组中IL-18蛋白的相对表达量为1.46±0.42，而对照组和空白对照组相对表达量分别为0.59±0.25、0.53±0.36。两对照组间IL-18蛋白相对表达量比较差异无显著性(P>0.05)；与两对照组比较，实验组IL-18蛋白相对表达量明显增高，差异均有显著意义(F=31.22，P<0.05)。见图5。

a：第3代hUMSCs细胞(普通光，100倍)；b：感染5 d时hUMSCs细胞(普通光，200倍)；c：感染5 d时hUMSCs细胞(荧光，200倍)。

图2 流式细胞仪鉴定人脐带间充质干细胞表型特征

MOI值：A=70，B=50，C=30，D=10。100倍。

M:标准参照物，①实验组，②对照组，③空白对照组。

A：GAPDH，B：IL-18。

3 讨 论

目前，常用肿瘤的基因治疗载体主要有病毒载体和非病毒栽体两类，病毒性载体的优点是转染效率高，但受免疫原性、细胞毒作用、携带外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等问题困扰，其研究和应用受到一定限制；非病毒性载体的优点就是安全、制备简单及携带外源性基因的容量巨大，但其转染效率较低、基因表达时间较短也影响其应用[4]。如何建立安全有效的治疗基因导入系统成为研究者们首要解决的问题。

MSCs是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，同时具有增殖能力强、向肿瘤迁移等重要的生物学特性，该细胞能被高效转染并表达外源性目的基因，且不因转染外源基因而致改变。尤其MSCs的趋化追踪能力，可使其迁移至无法实施手术切除甚至影像学无法发现的肿瘤转移灶，通过表达抗肿瘤分子清除转移灶，进而降低肿瘤复发的概率，特别是对转移性较强的肿瘤具有重要治疗价值，在肿瘤基因治疗领域具有广阔的应用前景[5-6]。目前研究表明，骨髓来源MSCs的应用具有一定局限性，随着明显减少的干细胞数量、老化的年龄和下降的增殖分化能力，骨髓量也有提取限制，取材时对病人也有损伤，而且移植给异体有发生免疫反应的风险。更原始、更低的免疫原性使hUMSCs一般不引起免疫反应。其优点还有：从产妇婴儿身上取材方便且安全性高，没有道德、伦理学的限制，以及感染及传播潜伏性病毒和病原微生物概率较低等[7]。

IL-18是一多效性细胞因子，具有诱导γ干扰素产生、增强自然杀伤细胞和毒性T淋巴细胞活性、诱导辅助T细胞等多种生物学功能。它能通过激活T细胞和巨噬细胞来诱导癌细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成，并且能与其他因子协同抗肿瘤或直接杀灭肿瘤细胞，发挥强大的抗肿瘤作用[8]。

本研究从人脐带组织中成功分离出hUMSCs，将携带IL-18基因的慢病毒转染至hUMSCs，构建的IL-18-hUMSCs培养后稳定表达IL-18 mRNA和蛋白，表明hUMSCs作为IL-18的有效运载工具是切实可行的。IL-18-hUMSCs既能发挥MSCs的靶向肿瘤部位的特性，又能发挥IL-18抗肿瘤效应，可作为肿瘤靶向基因治疗新选择。

[参考文献]

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