急性淋巴细胞白血病病人Ikaros6基因表达及意义

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(青岛大学医学院，山东 青岛 266021 1 血液学教研室； 2 附属医院血液病研究室)

Ikaros是Kruppel家族中锌指转录因子之一，其对淋巴细胞分化、增殖和功能维持具有重要的调控作用[1-4]。编码Ikaros蛋白的基因(IKZF1)由N端4个结合DNA的锌指域和C端有2个蛋白相互作用的锌指域构成，其基因外显子的不同剪接转录可以编码至少12种不同的锌指蛋白(Ikaros1～Ikaros12)，均具有不同的DNA结合能力及特异性[3]。Ikaros要发挥结合DNA作用至少需要3个N端的锌指结构，而一旦缺失两个或以上的锌指结构，其蛋白与DNA结合能力就会下降，也不具备转录活性，同时也会抑制其他异构体对DNA的结合能力，表现为显性负效应(DN)[5]。有研究表明，Ph染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(Ph+-ALL)病人中Ikaros6 基因的突变率较高、治疗效果差[6-9]。但络氨酸酶抑制剂(TKIs)和VDCP这两种治疗方案对Ph+-ALL病人的治疗效果尚未见详细报道。本研究旨在进一步明确Ikaros6基因异常表达与Ph+-ALL治疗效果的相关性。

1 对象和方法

1.1 研究对象

2011年7月—2013年7月，在青岛大学医学院各附属医院就诊的ALL病人95例，男46例，女49例；年龄16～82岁，中位年龄49岁。Ph+-ALL病人分别接受TKIs联合化疗治疗和仅VDCP(长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)、环磷酰胺(CTX)、强的松(Prec))治疗。因Ph染色体阴性的ALL(Ph--ALL)病人Ikaros6基因表达低，故不再进行跟踪随访。以上病人的诊断、治疗及疗效判定标准均参照文献[10]。选择10例健康体检者为健康对照组，男5例，女5例；年龄18～58岁，中位年龄38岁。

1.2 染色体核型分析

将ALL病人骨髓细胞按(1～2)×109/L的密度接种于RPMI 1640培养基中，培养24 h，于收获前1 h，加入0.05 mg/L秋水酰胺终止反应[11]。采用气干法制片进行染色体R显带；每例病人于油镜下分析10～20个分裂中期细胞，依据《人类细胞遗传学国际命名体制(1995)》观察有无染色体异常。

1.3 RT-PCR检测Ikaros6基因表达

1.3.1总RNA提取 取肝素抗凝的骨髓液2 mL，加等量的人淋巴细胞分离液，以2 000 r/min 离心15 min，分离单个核细胞，加Trizol试剂(美国Invitrogen公司)1 mL，按照试剂说明书进行细胞总RNA提取并检测RNA纯度(A260/A280>1.60)及完整性(28S、18S、5S等3条清晰亮带)。

1.3.2cDNA合成 应用Thermo逆转录试剂盒(Fermentas公司)合成cDNA。反应体系20 μL，含总RNA 1 μg、0.5 g/L的OLigo(dT)18引物1 μL，使用DEPC水补充至12 μL；快速轻微离心后，置65 ℃孵育5 min，立即置于冰上；然后依次加入5×缓冲液4 μL、RNase抑制剂1 μL、10 mmoL/L dNTP Mix 2 μL、逆转录酶(M-MuLV) 1 μL混匀，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-80 ℃冻存备用。

1.3.3PCR反应 PCR反应体系10 μL，含逆转录产物1 μL，20 μmol/L的Ikaros6正、反义链引物各0.5 μL，5×PCR Mix 5 μL，用DEPC水补至10 μL。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃再延伸7 min。所用引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，Ikaros6 正义链为5′-CGACGCACAA-ATCCACATAA-3′，反义链为5′-GCAGCAGCAGGTTCTCCAC-3′。

1.4 基因测序

将标本外送到金斯瑞生物科技公司进行纯化并测序。运用BLAST对测序结果和正常序列(基因库ID:NM006060)进行比对，确定相对应的突变位置和类型[12]。

1.5 荧光定量PCR检测Ikaros6基因的表达

1.5.1荧光定量PCR反应 PCR扩增反应体系为50 μL，含10 mg/L 模板DNA 5 μL，20 μmol/L的Ikaros6正、反义链引物各0.5 μL，Fast Start Universal SYBR Green Master 25 μL和DEPC水19 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，62 ℃退火、延伸60 s，40个循环。然后进行熔解曲线分析，由62 ℃始以0.1 ℃/s上升至96 ℃，最后冷却至40 ℃。Ikaros6引物和1.3.3中所用引物相同，设内参照GAPDH，引物序列为：正义链5′-C-AAGGTCATGACAACTTTG-3′，反义链5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.5.2荧光定量PCR结果计算 Ikaros6 mRNA相对表达量以2-△△CT表示，△△CT=(△CTIkaros6初诊-△CT内参照)-(△CTIkaros6缓解-△CT内参照)[12]。其中CT值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。两组间计量资料的比较采用t检验，计数资料的比较采用卡方检验，以P<0.05表示差异有显著意义。

2 结 果

2.1 ALL病人染色体核型分析

本文95例ALL病人中，45例检测到Ph染色体，其中38例为典型易位即t(9;22)(q34;q11)，7例为变异易位；50例未检测到Ph染色体。

2.2 Ikaros6基因的表达

本文45例Ph+-ALL病人中有13例(28.9%)表达Ikaros6基因，50例Ph--ALL病人中仅有2例(4.0%)表达该基因，Ph+-ALL病人Ikaros6基因表达率明显高于Ph--ALL病人(χ2=11.03，P<0.05)。健康对照组中均未检测到Ikaros6基因的表达。见图1。

2.3 Ikaros6基因测序

对克隆筛选出来的表达Ikaros6基因的标本进行测序，证实Ikaros6基因突变是由于IKZF1中外显子4～7的缺失所致。见图2。

M：Marker 2000；①、②表达Ikaros6基因；③、④分别表达Ikaros1和Ikaros2基因。

图2 Ikaros6基因测序图

2.4 Ikaros6基因与临床疗效

2.4.1Ph+-ALL病人初诊时和缓解后Ikaros6基因表达的比较 12例初诊病人Ikaros6 mRNA平均表达量(△△CT=3.4)明显高于缓解后(△△CT=5.0，11例，1例病人始终未达到血液学上的缓解)，差异有显著性(t=4.054，P<0.05)。

2.4.2Ikaros6基因表达与初诊病人短期缓解率表达Ikaros6基因的病人中，6例接受TIKs治疗仅1例(16.67%)获得缓解，7例接受VDCP治疗有2例(28.57%)获得缓解，两组比较差异无显著意义(P>0.05)。未表达Ikaros6基因的病人中，7例接受TIKs治疗6例(85.71%)获得缓解，25例接受VDCP治疗仅9例(36.00%)获得缓解，两组比较差异有显著性(χ2=5.43,P<0.05)。接受TIKs治疗的病人中，表达Ikaros6组的缓解率明显低于未表达Ikaros6组(16.67% vs 85.71%)，差异有统计学意义(χ2=6.20,P<0.05)。接受VDCP治疗的病人中，表达Ikaros6组和未表达Ikaros6组的缓解率(28.57% vs 36.00%)比较差异无显著性(P>0.05)。

2.4.3Ikaros6基因表达与累积复发时间 经随访，Ph+-ALL病人中表达Ikaros6基因者20个月平均累积复发时间明显短于未表达Ikaros6基因者(4.6月vs 12.2月；Waldχ2=13.72,P<0.05)。

3 讨 论

Ph染色体是成人ALL最常见的重现性细胞遗传学异常，约占20%～30%，它也是影响ALL预后的重要因素之一。如何对ALL进行快速诊断、分类并作出相应的合理治疗，已引起国内外学者的普遍关注。Ikaros在造血细胞，特别是B细胞的发育和分化中具有重要的作用，Ikaros基因一旦发生突变，转录水平的表达将会进一步减少或抑制正常功能基因亚型与DNA的结合，最终引发相应白血病。然而，在ALL病人中，异常的Ikaros6 基因表达与急性白血病的发生、发展及预后等方面是否有关联，至今尚无明确的结论。

本研究结果显示，IKZF1中外显子4～7的缺失是导致Ikaros6基因表达的主要原因，该基因在Ph+-ALL病人中高表达，与IACOBUCCI等[7]和MARTINELLI等[9]的研究结论基本一致。说明Ikaros6基因突变能抑制或减少正常基因活性，是Ph+-ALL发病机制的重要因素。然而，Ikaros6基因阳性的Ph+-ALL具体发病机制尚不清楚，目前认为可能与以下因素有关：Ikaros基因与前B细胞中c-myc的启动子结合，抑制前B细胞中c-myc的表达，Ikaros6 基因抑制或减少其他Ikaros基因与DNA的结合，从而引起c-myc基因高表达，导致前B细胞的过度增生[13]；Ikaros基因可以调节B细胞中JAK-STAT信号通路[14]，突变的Ikaros6基因可不断激活该信号通路，从而导致B细胞过度增生。

荧光定量PCR是一种核酸定量技术，其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点，故本研究采用该方法检测Ikaros6阳性病人mRNA表达量。结果显示，初诊时Ikaros6 mRNA具有较高的表达量，这可能与Ikaros6 mRNA转录的动态表达量和临床分期相关，在疾病的初发期，其转录水平明显增高，治疗达到缓解后，其表达量明显下降。

通过随访显示，未表达Ikaros6 基因的病人，采用TKIs治疗可获得较高的缓解率，目前仍然是最佳的治疗方案，而Ikaros6基因阳性表达的病人，两种治疗方案的缓解率均较低，这说明在Ph+-ALL病人中，Ikaros6基因表达对TKIs具有明显的抵抗性。MARTINELLI等[9]的研究结果显示，在Ph+-ALL病人中，异常的Ikaros6基因表达与抵抗TKIs的治疗之间存在一定的相关性。本文的研究结果与其一致。CHARLES等[15]的研究结果也表明，Ikaros6 基因表达与B-ALL病人的预后不良存在联系。目前TKIs治疗Ph+-ALL病人的疗效尚存在不同意见，VIGNETTI等[16]认为，Ph+-ALL病人接受TKIs治疗有较高的完全缓解率，接近98%～100%，这可能与不同种族及样本量的多少有关。

Ph+-ALL病人中表达Ikaros6基因者20个月平均累积复发时间明显短于未表达Ikaros6基因者，阳性表达病人均在1年内复发。说明Ikaros6基因在Ph+-ALL的发生发展过程中起着重要的作用，并与病人的疗效和预后有着密切的联系。同时，表达Ikaros6基因的Ph+-ALL病人对TKIs的治疗具有抵抗性，且治疗后易复发。

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