鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤与EB病毒感染的相关性

王海娟，李慧，王笑峰，王云，邢晓明，罗兵

(青岛大学医学院,山东 青岛 266021 1 附属医院检验科; 2 微生物学教研室; 3 附属医院病理科)

鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL) 是2001年由WHO正式命名的一种非霍奇金淋巴瘤，该病具有独特临床表现以及细胞形态、免疫表型和遗传学特征，是我国常见的非霍奇金淋巴瘤亚型之一[1-2]。ENKTCL的发生与EB病毒(EBV)感染密切相关，具有地域性，EBV感染是其致病因素还是伴随现象，目前已成为ENKTCL病因学的研究热点[1,3]。不同来源的EBV毒株在基因变异和生物学功能方面具有差异性，因此是否存在高致癌性的EBV变异毒株一直倍受关注。目前对ENKTCL中EBV基因型别的研究多集中于1/2分型，对F/f变异和C/D变异的研究较少[3]。LMP1 基因是公认的EBV恶性转化基因，HU等[4]和CHEN等[5]在研究鼻咽癌时发现存在30 bp碱基缺失的LMP1基因，且缺失型LMP1与无30 bp碱基缺失的野生型比较具有更强的致瘤性和细胞转化能力。有关鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等肿瘤以及良性淋巴组织增生疾病中LMP1缺失型基因的情况已有报道，但结果不一[4-6]。本研究旨在检测ENKTCL中EBV的感染情况，探讨EBV阳性ENKTCL组织中病毒基因型以及LMP1编码基因的变异情况，为进一步研究EBV感染与ENKTCL的关系提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

ENKTCL组织标本75例取自青岛大学医学院附属医院病理科2008年6月—2013年6月病理确诊病例，其中男45例，女30例；病人年龄13～77岁，中位年龄50岁。发病部位主要为鼻腔、鼻咽等上呼吸道。实验所用EBV阳性细胞系B95-8、Raji和EBV阴性Ramos细胞购自北京协和细胞资源中心，EBV阳性细胞系P3HR-1由日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。

1.2 原位杂交筛选EBV阳性标本

按参考文献方法[7]设计EBER1特异性寡核苷酸探针，Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling Kit标记探针购自Roche公司。石蜡包埋组织切片二甲苯脱蜡后乙醇梯度水化，用40 g/L甲醛溶液固定，蛋白酶K(100 mg/L)37 ℃消化15 min后，以1 g/L甘氨酸溶液轻洗30 s终止消化反应，加地高辛标记的EBER1寡核苷酸探针37 ℃杂交反应过夜。次日Blocking Buffer封片后加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，37 ℃反应1 h，最后加显色液(NBT/BCIP)置湿盒中37 ℃反应3 h，并用5 g/L甲基绿复染5～20 min。光镜下观察结果，细胞核浓染呈深紫色者为EBER1阳性。同步应用sense探针进行杂交反应特异性的检测。

1.3 石蜡包埋肿瘤组织DNA提取

因肿瘤较小，部分病例不能取得足够组织进行实验，本研究切取56例原位杂交阳性ENKTCL石蜡包埋组织各5～8片，每片厚度约4 μm，采用德国QIAGEN公司QIAAmp FFPE DNA提取试剂盒提取DNA进行分型研究，操作严格按照试剂盒要求进行。

1.4 EBV 1/2分型、F/f分型及C/D分型检测

依据基因缺失序列情况，参考文献方法[8-9]设计引物，采用PCR技术检测感染EBV的1/2分型，以PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术检测F/f分型以及C/D分型。

1.4.1PCR扩增 PCR反应体系为25 μL，包括DNA 模板3 μL，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L。循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩增35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物于含0.5 mg/L溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统记录结果。阳性对照的设置：细胞系B95-8作1型和F型对照；细胞系P3HR1为2型对照；细胞系Raji作为D型对照；本实验室已成功鉴定的1例f型ENKTCL标本为f型阳性对照。每次PCR反应均用无酶双蒸水作阴性对照。

1.4.2RFLP分析 采用德国QIAGEN公司凝胶DNA回收试剂盒对F/f分型、C/D分型的PCR产物进行回收，用BamH Ⅰ限制性内切酶消化。酶切体系15 μL，包括DNA 8 μL，10×K Buffer 1.5 μL，15×106U/L BamH Ⅰ 1 μL，无酶双蒸水4.5 μL，充分混匀后瞬时离心，30 ℃水浴4 h。取酶切产物5 μL于含0.5 mg/L溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统记录结果。细胞系B95-8的EBV BamH Ⅰ F片段无BamH Ⅰ识别位点即为F型(酶切产物电泳条带仍为198 bp)；f型对照标本在该区域出现BamH Ⅰ位点(PCR产物酶切后出现长127 bp和71 bp两条带)。细胞系Raji的 EBV BamH Ⅰ W1/I1交界区保留BamH Ⅰ识别位点为D型(PCR产物酶切后出现长130 bp和76 bp两条带)，酶切后仍呈单一条带(206 bp)者为C型。

1.4.3基因序列分析 选取经酶切鉴定的F/f分型和C/D分型的4种EBV型别的部分标本，采用末端终止法、由北京华大基因有限公司对PCR扩增产物进行双向测序，测序引物为PCR扩增引物。应用Primer premier 5软件检查序列有无BamH Ⅰ识别位点，对PCR-RFLP结果进行鉴定。

1.5 LMP1基因C端序列分析

参照文献的方法[10]设计检测LMP1基因C端30 bp缺失的特异性引物，采用PCR技术进行检测，反应体系和扩增条件同上。同时选取部分标本的产物进行测序以验证结果。

2 结 果

2.1 原位杂交

EBER1阳性信号位于肿瘤细胞的细胞核内，核浓染呈深紫色；毗邻切片的同一组织苏木精-伊红染色显示EBER1阳性信号均来源于肿瘤细胞。EBV阳性ENKCTL标本的组织切片用EBER1 sense探针杂交细胞核呈浅绿色，未出现阳性信号，证实了反应的特异性。本文75例ENKCTL标本中，共有67例EBER1阳性，阳性率为89.3%；发生在鼻腔部位的66例标本中有63例阳性，阳性率为95.0%。

2.2 EBV 1/2分型、F/f及C/D分型

1型EBV扩增条带长为498 bp，2型EBV长为150 bp；C型EBV限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切PCR产物后条带长为206 bp，D型EBV酶切后表现为长130 bp和76 bp两条带；F型EBV限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切PCR产物后条带仍为长198 bp，f型EBV酶切后表现为长127 bp和71 bp两条带。见图1。56例进行分型检测的EBV阳性ENKTCL标本中，1型EBV 45例(80.4%)，2型EBV 11例(19.6%)；F型EBV 49例(87.5%)，f型EBV 7例(12.5%)；C型EBV 37例(66.1%)，D型EBV 19例(33.9%)。PCR产物测序结果证实F型EBV无BamH Ⅰ酶切位点，而由于突变f型EBV增加了BamH Ⅰ酶切位点；C型EBV无BamH Ⅰ酶切位点，D型EBV则保留了BamH Ⅰ酶切位点。

2.3 LMP1检测

本文对48例EBV阳性ENKTCL标本LMP1的C端序列进行检测分析，结果表明，野生型8例(16.7%)，缺失型40例(83.3%)。部分标本LMP1基因C端PCR产物电泳图见图2，161 bp者为野生型LMP1变异，131 bp者为缺失型LMP1变异。PCR产物经测序验证结果可靠。

M:DNA Marker DL2000；④、⑦、、、、分别为1型、2型、F型、f型、C型、D型阳性对照；⑧、、为阴性对照；①～③为1型EBV标本；⑤、⑥为2型EBV标本,⑨～为F型EBV标本；、为f型EBV标本；～为C型EBV标本；为D型EBV标本。

图1部分EBV阳性标本基因分型电泳结果

M:DNA Marker DL2000；①～④为LMP1野生型标本；⑤～⑦为LMP1缺失型标本；⑧为阴性对照。

3 讨 论

ENKTCL在我国是一种较为常见的非霍奇金淋巴瘤，具有独特的临床病理特点，男性病人多于女性，年龄以40～50岁居多，好发于鼻腔[3]。EBV属于疱疹病毒科γ亚科DNA肿瘤病毒，90%以上的健康成人携带该病毒，虽然大部分EBV感染者一直处于隐性感染状态，但EBV感染可促使相关肿瘤的

产生。EBV感染与人类多种淋巴细胞和上皮性肿瘤的发生有关，例如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等，早在1997年的世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)的报告中，已经将EBV归类为致癌病毒[11-13]。在本研究中EBER1 原位杂交阳性率高达89.3%(56/75)，提示EBV感染与ENKTCL的发生密切相关，尤其是发生在鼻腔部位的病例，EBV感染率高达95.0%，而鼻外器官EBV感染率则相对较低，说明EBV感染有部位依赖性，可能是在鼻咽及口腔部位病理损伤的基础上，EBV于鼻咽部和口腔腺体上皮细胞中的长期潜伏诱发了ENKTCL[3]。

ENKTCL好发于亚洲及拉丁美洲等地区，这与EBV慢性感染者的地理分布相吻合，而且不同地区人群感染的EBV基因类型也不相同[3,14-15]。目前，对ENKTCL中EBV基因型别的研究多集中于1/2分型，而对F/f变异和C/D变异的研究较少[3]。本研究显示，本地区EBV感染以1型为主，与先前亚洲地区的报道结果相符[16-17]。有研究显示，1型与2型EBV的生物学功能存在差异，1型EBV的B细胞转化功能更强。本文结果提示，本地区ENKTCL的发生与细胞转化功能更强的1型EBV感染密切相关。而有关研究显示，在秘鲁及巴西ENKTCL病人中2型EBV感染占主导地位[3,14]。由此进一步说明不同EBV基因型在不同地区的分布不同。

本文结果显示，本地区ENKTCL病人EBV以F(87.5%)及C(66.1%)型变异较为多见，与本地区鼻咽癌组织中EBV的基因类型相符[18]。SIDAGIS等[19]报道，日本EBV相关T/NK淋巴细胞瘤组织中C型和F型变异率较高，分别为72.7% (8/11)和100% (11/11)，且F型和C型EBV也是EBV相关胃癌和鼻咽癌的主要毒株；而在欧洲和北美地区鼻咽癌组织中则以D型及f型EBV毒株为主[20]。由此可见，不同地区感染EBV基因类型有所不同，本地区EBV阳性ENKTCL组织中感染的EBV以1型、F型和C型为主，而不同类型EBV基因变异对ENKTCL发生发展的影响有待进一步研究。

作为公认的EBV转化基因和致癌基因，LMP1能诱导Bcl-2 基因产物表达，阻止细胞凋亡，从而使EBV感染细胞永生化，还可在体外转化哺乳动物纤维母细胞和人角质细胞，抑制人上皮细胞的分化和凋亡，诱导表皮生长因子受体的表达，促进肿瘤的转移，且在大多数EBV相关肿瘤组织中表达，在肿瘤的发生中具有重要作用[21]。而且有关鼻咽癌的研究结果显示，LMP1缺失型与野生型比较致瘤性和细胞转化能力更强[4-5]。在国内尚未有ENKTCL组织中LMP1缺失型与野生型的详尽报道。本研究结果显示，在ENKTCL中感染的EBV以LMP1缺失型为主，提示LMP1编码基因C端30 bp碱基的缺失可能与ENTKCL的发生有一定相关性。有研究认为，这种缺失型的致瘤性和细胞转化能力明显增强，且免疫原性减弱，可能是因为LMP1基因的30 bp碱基缺失处正位于NF-κB 的上游，在形成淋巴瘤后缺失型LMP1被激活, 促使NF-κB异常活化, 从而产生抗凋亡性; 也可能是由于部分遗传结构的丢失减弱了LMP1蛋白的免疫原性, 使之较易逃避机体的免疫监视, 最终延长并增强了LMP1的致瘤作用[6]。LMP1缺失型在ENKTCL发生中的致瘤作用尚未明确，本研究拟进一步扩大样本量, 在蛋白水平上直接检测LMP1野生型和缺失型基因的表达情况, 深入探讨LMP1野生型和缺失型在ENKTCL发生中的意义。

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