不同单菌制曲豆酱风味物质及氨基酸分析比较

康蕾，胡茂丰，刘素纯,3*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

不同单菌制曲豆酱风味物质及氨基酸分析比较

康蕾1，胡茂丰2，刘素纯1,3*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

分别采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.042、高大毛霉（Mucor mucedo）、根霉（Rhizopus）和黑曲霉（Aspergillus niger）制曲制酱，对后发酵黄豆酱中氨基酸态氮、风味物质和游离氨基酸进行测定分析，发现在45 d氨基酸态氮含量最高，在45～65 d时氨基酸态氮含量保持稳定；判定65 d为发酵终点。测得米曲霉65 d挥发性物质是4种酱中最丰富的，测定米曲霉豆酱游离氨基酸含量为4种酱中最多，为174.17 mg/g干质量，且种类最丰富。

黄豆酱；氨基酸组成；风味物质；固相微萃取；气质联用

黄豆酱的生产始源于中国，它是我国人民的传统调味品，因其特有的风味、丰富的氨基酸含量深受广大人民的喜爱。其香气成分包括黄豆本身、霉菌代谢产物及非酶化学反应生成物[1-2]，而人工制曲的黄豆酱香气成分又与制曲菌种有一定的关系，不同菌种分解黄豆能力不同，产生的化学物质也不一样。后发酵阶段，在豆子中的酶以及微生物酶的作用下蛋白质降解为小分子的肽和游离氨基酸，由于氨基酸和肽有各自的滋味，它们又与其他成分协同作用使得风味物质更加复杂。

李保英[3]通过采用不同菌种制曲制酱来研究酱油产生香味的机理，但此研究未对后发酵阶段挥发性成分进行分析比较。徐琳娜等[4]只对一种蚕豆酱在后发酵不同时间段的挥发性成分和氨基酸作了比较，未结合氨基酸测定进行定量分析。本实验通过采用不同菌种制曲，同一后发酵条件制酱，通过氨基酸态氮含量变化结合气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其挥发性成分变化，将游离氨基酸含量作为终产品评定标准，从而探讨更充分利用黄豆营养成分的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆：湖南农业大学农贸市场；米曲霉（Aspergillus oryzae）、根霉（Rhizopus）、高大毛霉（Mucor mucedo）、黑曲霉（Aspergillus niger）：食品科学与生物技术湖南省重点实验室提供。

实验所用主要化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

L-8800日立型氨基酸自动分析仪、CR7日立Hitachi离心机：日本日立公司；7890A气相色谱仪、5975C质谱仪（GC-MS）：美国安捷伦公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司。

1.3方法

1.3.1 黄豆酱加工工艺流程及操作要点

操作要点：大豆除杂，清洗3遍，除去不饱满颗粒，浸泡10 h，沥干，121℃蒸煮25 min，待豆子冷却到40℃加入菌种，放入28℃培养48 h，再加入等量的10%质量分数的盐水拌匀，放入陶瓷坛子中置于45℃培养箱进行后熟。

1.3.2 氨基酸态氮含量测定

用米曲霉、根霉、高大毛霉和黑曲霉分别制黄豆酱坯，用10%的盐水拌匀，放入陶瓷坛子中置于45℃保温腌制，每5 d取样3次，用甲醛法[5]测定氨基酸态氮含量。

1.3.3 气质联用分析不同发酵时期黄豆酱香气成分

采用顶空固相微萃取不同菌种发酵不同时期的酱的香气成分，再进行气质联用分析香气成分种类和含量。

顶空固相微萃取条件[4]：选用75 μm CAR/PDMS固相微萃取头，前先将萃取头置于进样口处在250℃老化1 h，以除去污染，取3 g样品加入气质专用瓶10 mL，在55℃条件下，保持15 min，再用萃取针萃取30 min，萃取完插入进样口，保留5 min。

色谱条件：毛细管柱为PEG20M，液膜厚度0.25 μm，孔径为0.25 μm。

升温条件：在50℃保持3 min，以10℃/min上升至150℃，再以8℃/min的速度上升到290℃，保持10 min。气化室温度：250℃，载气为氦气，流速1.0 mL/min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，灯丝发射流200 μA，离子源温度250℃，接口温度220℃，扫描范围：45～500 m/z。

定性、定量方法：GC-MS测定出的总离子流色谱图通过美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）08数据库分析，计算出各香气成分相对含量。

1.3.4 游离氨基酸分析

对不同菌种发酵腌制65 d进行游离氨基酸测定[6]。

55℃条件下进行样品干燥，烘干至质量恒定。取豆酱恒质量干粉0.5 g，放入25 mL比色管，加8.3%三氯乙酸溶液至刻度，用封口膜封口，摇匀，室温下超声90 min，取上清液8 mL 4℃冷冻离心3 000 r/min，离心30 min，真空浓缩4 h，1 500 r/min。加入1 mL 0.01 mol/L HCl摇匀，6 000 r/min冷冻离心15 min。取上清液进行上样。

利用日立L8800全自动氨基酸分析仪，PF生理体液法，Li分离柱分离。样品经过分离柱利用四种流动相梯度洗脱后进入反应柱，135℃下与茚三酮及缓冲液反应，最后进入检测器检测吸光度值。分离柱利用PF-RG洗脱可再生。

色谱条件：缓冲液流速0.35 mL/min，茚三酮流速0.30 mL/min，通道1：检测波长570 nm，通道2：检测波长440 nm，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 氨基酸态氮含量的动态变化

采用4种不同菌种发酵黄豆酱，比较产品氨基酸态氮含量的结果见图1。由图1可知，4种酱在0～45 d，氨基酸态氮含量总体呈现上升趋势，其中米曲霉酱氨基酸态氮含量在整个时间段内都比其他3种酱高。由此可见，米曲霉的蛋白酶水解作用较其他3种菌强，从而形成更多的氨基酸[7]。在45～65 d时，4种酱氨基酸态氮含量趋于稳定，故选取第65天进行挥发性成分的测定。

图1 氨基酸态氮含量在发酵过程中的变化Fig.1 Change of amino acid nitrogen content during fermentation

2.2 豆酱香气成分GC-MS分析

4种不同菌种后发酵65 d采用GC-MS分析豆酱挥发性成分，其总离子流色谱图见图2，其相对含量结果见表1。

图2 豆酱65 d中挥发性组分GC-MS总离子流图Fig.2 Chromatogram of soybean paste fermented 65 d by different strains

由表1可知，利用不同菌种制曲的黄豆酱其挥发性成分有差异，后发酵天数不同对挥发性成分也有影响[8]。

4种酱共检测出49种物质，其中醇类7种，醛类6种，酮类3种，酚类2种，酸类5种，烷烃类6种，酯类10种，其他物质9种。

4种酱中醇类物质最为丰富，所占百分比分别为30.96%、56.05%、41.44%、39.89%。4种酱都有2,3-丁二醇和1-辛烯-3醇。其中2,3-丁二醇是3-羟基-2-丁酮发生反应生成。2-甲基丁醇，戊醇是酱风味物质的主要构成[9]。

4种酱的醛类物质所占百分比分别为24.58%、9.39%、21.16%、16.45%。4种豆酱中都检测出的是异戊醛和苯乙醛。黄豆酱产生的刺激性气味大多是醛类，而低分子质量的醛类主要来自氨基酸降解和微生物转化[10]，比如苯甲醛，苯乙醛是由苯丙氨酸降解得到[11-12]，由此可知，苯丙氨酸的含量发生下降。同时苯甲醛具有坚果香气。

4种酱酮类物质所占百分比分别为8.12%、6.36%、7.06%、4.86%。在4种酱中均检测出3-辛酮，4-羟基-3-甲基苯乙酮。3-羟基-2-丁酮并未检测出，可能完全转化成醇。

4种酱中均检出愈创木酚和麦芽酚，所占百分比分别为4.24%、13.78%、53.88%、4.55%，酚类物质对酱香有重大贡献。

4种酱的酸类物质所占百分比分别为6.01%、11.55%、10.48%、18.47%。4种酱都有正戊酸和2-甲基丁酸，分别来源于亮氨酸和缬氨酸的降解[13]。

4种酱的烷烃类物质所占百分比分别为9.99%、1.00%、2.00%、3.68%。

4种酱的酯类物质所占百分比分别为5.83%、1.60%、13.98%、7.97%。检出的多数以乙酯形式存在。酯类化合物是酱香气成分的主体，使酱具有香甜浓郁的味道。醇和酸可以形成酯类，酵母也可以发生化学反应形成酯类[14]。

2.3 黄豆酱中游离氨基酸含量分析

对4种不同单菌种制曲后发酵65 d黄豆酱的游离氨基酸测定结果分别见图3和表2。

图3 黄豆酱游离氨基酸色谱图Fig.3 Chromatogram of free amino acids of soybean paste

由表2可知，总游离氨基酸含量由高到低依次为米曲霉＞根霉＞黑曲霉＞高大毛霉。米曲霉制曲的豆酱游离氨基酸含量为174.17 mg/g干质量，高于其他3种，其氨基酸种类有32种，高大毛霉检测出28种，根霉和黑曲霉检测出30种。根据氨基酸的呈味特征[15-16]，苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸呈现甜味，谷氨酸和天门冬氨酸呈酸味，组氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸本身具有微苦的物质，天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸有具有鲜味[17-18]。由表2可知，呈苦味氨基酸的含量最高，其次是鲜味氨基酸，甜味氨基酸，酸味氨基酸。游离氨基酸中7种必需氨基酸含量最高是米曲霉，含量为72.38 mg/g，还含有含有婴儿生长发育期间所必需的组氨酸3.72 mg/g。

3 结论

氨基酸态氮含量是黄豆酱国标当中的重要指标，也是呈味物质，与风味的形成密切相关。试验根据4种酱后发酵氨基酸态氮含量变化规律，发现4种酱挥发性物质具有相同变化趋势，GC-MS检测发现醇类物质，且酚类、醛类物质含量上升，这一研究结果与赵建新[19]对于黄豆酱后发酵挥发性物质的变化的研究相一致。醇类、酯类、酚类对香味的形成贡献最大，对酱的感官品质影响也很大。2,3-丁二醇和1-辛烯-3醇，异戊醛和苯乙醛，3-辛酮和4-羟基-3-甲基苯乙酮，正戊酸和2-甲基丁酸，愈创木酚和麦芽酚，棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和油酸乙酯是4种酱中都能检测出来的，可以作为豆酱的特征性风味物质。试验发现米曲霉酱挥发性物质种类最丰富，米曲霉的醇类、酯类、酚类比例相对协调，香气更柔和。

游离氨基酸测定也发现米曲霉酱游离氨基酸含量最高，为174.17 mg/g，并且种类最为丰富，因此，更能满足人体需要。黄豆酱产生的低分子质量的醛类主要来自氨基酸降解和微生物转化，苯甲醛，苯乙醛来自于苯丙氨酸的降解，4种酱都有的正戊酸和2-甲基丁酸分别来源于亮氨酸和缬氨酸的降解。4种酱中呈苦味氨基酸的含量最高，其次是鲜味氨基酸，甜味氨基酸，酸味氨基酸，这可能与黄豆本身所含的氨基酸有关，徐琳娜[20]的研究表明豆瓣酱游离氨基酸中4种味道的氨基酸比例相一致。高大毛霉制曲的酱中游离氨基酸含量最低为63.05mg/g，且种类比其他3种酱少。

试验证明分别用米曲霉，高大毛霉，根霉，黑曲霉制曲制酱时，米曲霉制曲酱的氨基酸态氮含量高达0.856 g/kg，结果表明其挥发性物质种类多于其他3种酱，对香味有贡献的物质含量最多，在香味和营养价值方面最理想，高大毛霉最不理想。

结果表明，用米曲霉制得的黄豆酱比另外3种更能充分利用黄豆的成分，产生的蛋白质更高，更加利于人体吸收，为今后进一步研究米曲霉制曲制酱提供一定依据。

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Comparison of flavor compounds and amino acids of soybean paste fermented by different moulds

KANG Lei1,HU Maofeng2,LIU Suchun1,3*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

Koji and soybean paste were made usingAspergillus oryzaeAS3.042,Mucor mucedo,RhizopusandAspergillus nigeras fermentation starter,respectively.The amino acid nitrogen,flavor compounds and free amino acids contents of the products were determined and analyzed.The highest content of amino nitrogen was in 45 d,and amino nitrogen remained stable from 45 d to 65 d.At the 65 d,the soybean paste fermented byA. oryzaehad the most abundant volatile components and amino acids,and the free amino acid content was the highest of 174.17 mg/g dry weight.

soybean paste;amino acid composition;flavor components;solid-phase micro-extraction;GC-MS

TS207.3

A

0254-5071（2014）11-0140-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.032

2014-09-26

湖南省科技计划项目（2012NK3072）

康蕾（1990-），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。

*通讯作者：刘素纯（1966-），女，教授，博士，研究方向为营养与食品卫生学。