蛇龙珠葡萄（烟台产区）自然发酵醪中选育的酿酒酵母发酵特性研究

韩鹏，程仕伟，，姜文广，赵慧，侯小芳，徐岩，李记明*

（1.烟台张裕集团有限公司山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台265709；2.鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025；3.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

蛇龙珠葡萄（烟台产区）自然发酵醪中选育的酿酒酵母发酵特性研究

韩鹏1，程仕伟1，2，姜文广1，赵慧2，侯小芳2，徐岩3，李记明1*

（1.烟台张裕集团有限公司山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台265709；2.鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025；3.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

对烟台产区蛇龙珠葡萄自然发酵醪中筛选的12株酿酒酵母进行发酵特性研究。首先对发酵终止后的残糖量和酒精体积分数测定，再对部分菌株进行耐酒精、耐酸、耐SO2和耐高糖能力测定，选取3株发酵性状较好的酿酒酵母用于蛇龙珠干红葡萄酒酿制。结果菌株YSF4的发酵特性良好，发酵后酒样指标较好，甚至优于商品化酵母，具备工业葡萄酒酿造应用潜力。

蛇龙珠；自然发酵；酿酒酵母；发酵特性

蛇龙珠（Cabernet Gernischt）为解百纳干红酿造的主要原料之一，是我国特有的葡萄酒原料品种，也是我国第二大酿酒葡萄栽培品种（仅次于赤霞珠），已有超过110年的种植历史[1-2]。蛇龙珠最初只在中国烟台大规模种植，直至20世纪80年代末期才在全国范围内推广种植，目前烟台产区的蛇龙珠酿酒葡萄栽培面积已接近6 667 hm2，约占全国的70%[3]。

微生物尤其是酿酒酵母是葡萄酒品质的决定性因素，采用不同酿酒酵母和相同葡萄原料发酵生产的葡萄酒，在色泽、香气、感官质量以及出酒率等方面都存在较大的差异[4-7]。目前我国葡萄酒产业的一个突出问题是大量使用商品化活性干酵母导致葡萄酒品质同质化严重，拥有核心竞争力和地域特色的高品质葡萄酒品种偏少[8-11]。鉴于蛇龙珠葡萄是我国特有品种且在烟台产地种植多年，其中必定蕴藏着丰富的本土酿酒资源。因此本研究的目的是通过多布点取样并自然发酵，筛选能够适应蛇龙珠葡萄酒酿造的高品质本土酿酒酵母。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿造干红的蛇龙珠原料：蓬莱大柳行葡萄种植基地；商品酵母D254和RC212：法国Laffort公司；酵母粉和蛋白胨：OXOID公司；其余试剂均为分析纯或生物纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；SWCJ-1B超净工作台：苏州安泰；H1850R离心机：湖南湘仪实验室仪器；WineScanTM葡萄酒分析仪：丹麦FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 酿酒酵母的筛选

蛇龙珠酿酒葡萄破碎除梗后自然发酵3 d后，涂布孟加拉红培养基（葡萄糖10g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.5g/L，蛋白胨5g/L，孟加拉红0.0133g/L，氯霉素0.1g/L，琼脂20g/L，pH 6.5）。平板至长出单菌落，挑取单菌落转接WL培养基平板（酵母粉4g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.55g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，FeCl30.002 5 g/L，MnSO40.002 5 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，琼脂20 g/L，pH 5.5），培养5 d后观察菌落形态。

1.3.2 还原糖与酒精度测定

筛选的酿酒酵母首先经活化培养基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）活化20 h，接种环蘸取菌种入10 mL发酵培养基（葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）试管中，以商品化酵母D254为对照，28℃恒温培养，发酵6 d后测定还原糖和酒精度。采用DNS比色法测定还原糖的含量，重铬酸钾比色法测定酒精度[12]。

1.3.3 酿酒酵母耐受力测定

采用不同酒精体积分数（10%、13%、16%、19%）、柠檬酸质量浓度（5 g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L）、SO2质量浓度（60 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L）和葡糖糖质量浓度（200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L）的10 mL发酵培养基（内装有杜氏管），接种已活化的菌液一环，以商品化酵母D254为对照，28℃恒温培养48 h，依据杜氏管充满CO2气体时间来判定酿酒酵母的耐受力。

1.3.4 发酵生产干红葡萄酒

菌种经活化培养基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.5）活化20 h后，在8℃、10 000 r/min条件下离心收集菌体，加无菌水混旋后离心洗涤2次，收集菌体备用。

成熟期的蛇龙珠酿酒葡萄经除梗破碎机粉碎，装入20 L发酵瓶，装液量15 L，按照10%的接种量接入酿酒酵母（活化培养基体积计），混匀后室温条件下发酵，定期称质量。发酵5 d后进入终止期，酒样经5 000 r/min离心后利用葡萄酒分析仪测定酒精体积分数、总酸、挥发酸、残糖，比色法测定单宁、色度、花色苷和总酚[13-15]。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母筛选

自张裕公司蓬莱、龙口和莱州种植基地分别采摘成熟期蛇龙珠酿酒葡萄，除梗破碎后分别装入事先灭菌的1 L发酵瓶进行自然发酵，发酵3 d后取酒样稀释涂布孟加拉红培养基平板，在28℃培养至长出单菌落，挑取酵母菌单菌落转接WL显色培养基，在28℃培养5 d。最终获得具有明显酿酒酵母特征的菌株12株，其在显色培养基上的生长形态为奶油色且稍带绿色、球形凸出、表面光滑、不透明，菌落形态见图1（以菌株YSF8为例）。WL培养基对酿酒酵母的鉴别准确度可达100%[16]，结果可信度高，故筛选的菌株为酿酒酵母。

图1 酿酒酵母YCF8在WL培养基上的生长形态Fig.1 Growth morphology ofS.scerevisiaeYCF8 in WL medium

2.2 产酒精能力与残糖量分析

以商品化酿酒酵母D254作为对照，在发酵培养基中发酵6 d后的发酵液中残糖量和酒精体积分数见表1。菌株YSF1、YSF2、YSF3、YSF4、YSF6、YSF8和YSF9的发酵后残糖与酒精体积分数与D254的发酵后数据差异不大，故作为后续深入研究的酵母菌株，而菌株YSF5、YSF7、YSF10、YSF11和YSF12的发酵液中残糖量均超过10g/L，酒精体积分数也相对较低。总体来看，发酵6d后的残糖量未达到干酒的标准（≤4 g/L），原因可能是发酵培养基中氮源较丰富，与葡萄原料成分差异较大所致。

表1 发酵液中残糖和酒精体积分数Table 1 Residual sugar and alcohol content in the broth

2.3 耐受酒精能力

酿酒酵母耐受酒精能力的结果见图2。工业化葡萄酒酿造过程中酒精体积分数一般为12%[17]，在10%、13%、16%和19%酒精体积分数条件下，供试酵母均有较好的酒精耐受力，能够满足发酵要求。其中YSF2、YSF4和YSF8在不同酒精体积分数下的耐受能力与商品酵母D254相当，具备应用潜力，而菌株YSF1、YSF3、YSF6和YSF9的耐受力尤其是耐受高体积分数酒精能力略差。

图2 酿酒酵母耐受酒精能力Fig.2 Alcohol tolerance ofS.cerevisiae

2.4 耐受SO2能力

酿酒酵母耐受SO2能力的结果见图3。葡萄酒工业生产中SO2在葡萄汁中添加量为一般为60～100 mg/L[18]，由图3可以看出，选育的酿酒酵母在60 mg/L、100 mg/L、150 mg/L和200 mg/L的SO2质量浓度条件下均能够快速起酵，满足葡萄酒酿造要求，其中YSF1、YSF2和YSF8的起酵速率优于商品化酵母。

图3 酿酒酵母耐受SO2能力Fig.3 SO2tolerance ofS.cerevisiae

2.5 耐酸能力

图4 酿酒酵母耐酸能力Fig.4 Acid tolerance ofS.cerevisiae

酿酒酵母的耐酸能力见图4。由图4可知，在柠檬酸质量浓度为5 g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L时，所用酿酒酵母均能够正常发酵，满足实际葡萄酒酿造要求。菌株YSF2、 YSF3、YSF4和YSF8的耐酸能力与商品酵母D254大致相当，而菌株YSF1、YSF6和YSF9对高质量浓度的有机酸的耐受力要低于D254。

2.6 耐高糖能力

供试菌株耐受高糖能力见图5。由图5可知，酵母菌YSF2、YSF3、YSF4和YSF8的耐受力与商品酵母D254无差异，而菌株YSF1、YSF6和YSF9对高质量浓度葡萄糖的耐受力要低于商品酵母D254。

图5 酿酒酵母耐高糖能力Fig.5 High glucose tolerance ofS.cerevisiae

2.7 酿酒酵母发酵生产干红葡萄酒

选取具有应用潜力的菌株YSF2、YSF4和YSF8进行发酵生产干红葡萄酒试验，以葡萄酒酿造生产中常用的商品酵母D254和RC212作为对照，发酵5d后测定各发酵参数指标，结果如表2所示。就酒精体积分数和总酸两个指标而言，选育的3株酵母菌与商品化酵母无明显差异，菌株YSF8的发酵酒样中挥发酸含量较高，并且其残糖为5.21 g/L，超过干红葡萄酒4 g/L的标准。菌株YSF4的发酵酒样中单宁和总酚含量是最高的，达到1 423.58 mg/L和1 140.44 mg/L，并且其花色苷含量和色度除略低于D254外，高于其余酿酒酵母的发酵酒样。经品尝，菌株YSF4的发酵酒样香气浓郁，有别于商品酵母的发酵酒样。综合以上研究结果，菌株YSF4具备工业化葡萄酒酿造潜力。

表2 发酵参数指标Table 2 Fermentation parameters of wine

3 结论

本试验首先经酵母菌发酵培养后的残糖量与酒精体积分数测定，筛选到7株发酵性状良好的酿酒酵母。在对供试菌株的耐受酒精、耐SO2、耐酸和耐高糖能力的结果进行比较研究基础上，筛选菌株YSF2、YSF4和YSF8用于发酵生产干红葡萄酒，结果表明，YSF4菌株的发酵酒样质量较好，部分指标优于商品化酵母，具备工业葡萄酒酿造应用潜力，后续香气成分指标分析研究工作正在进行中。

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Fermentation characteristics ofSaccharomyce scerevisiaescreened by spontaneous fermentation with Cabernet Gernischt grapes(Yantai region)

HAN Peng1,CHENG Shiwei1,2,JIANG Wenguang1,ZHAO Hui2,HOU Xiaofang2,XU Yan3,LI Jiming1*
(1.Key Laboratory of Fermentation about Wine Microorganisms in Shandong Province,Changyu Group Company Co.,Ltd., Yantai 265709,China;2.School of Life Sciences,Ludong University,Yantai 264025,China; 3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The fermentation characteristics of 12 strains ofSaccharomyce scerevisiaescreened by spontaneous fermentation with Cabernet Gernischt grapes(Yantai region)were studied.Firstly,residual sugar content and alcohol content were determined after fermentation termination,and then the tolerance of alcohol,acid,SO2,and high glucose concentration were determined.At last,three strains that have better fermentation characters were used to produce dry red wine of Cabernet Gernischt.The results indicated that the strain YSF4 had good fermentation characteristics,and the wine samples had good index after fermentation,even superior to the commercialization yeast,which was suitable for industrial wine brewing industry.

Cabernet Gernischt;spontaneous fermentation;Saccharomyce scerevisiae;fermentation characteristics

TS201.3；Q938.2

A

0254-5071（2014）11-0037-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.008

2014-08-25

国家高技术研究发展计划项目“863计划”（2013AA102108-3）

韩鹏（1984-），男，工程师，硕士，研究方向为葡萄酒酿造。

*通讯作者：李记明（1966-），男，研究员，博士，研究方向为葡萄酒酿造。