生物发酵法制丁二酸生产工艺的研究与应用

魏世康

（中国石化扬子石油化工有限公司化工厂，江苏南京210048）

生物发酵法制丁二酸生产工艺的研究与应用

魏世康

（中国石化扬子石油化工有限公司化工厂，江苏南京210048）

丁二酸是一种重要的化工原料，广泛用于食品、医药和化工等行业，市场前景广阔。微生物发酵法生产丁二酸具有高效、环保、可持续利用的特点，是一种新型的绿色化工生产工艺。本文介绍了微生物发酵法制备丁二酸的生产工艺并对其应用前景进行了展望。

丁二酸；生物发酵；工艺；应用

丁二酸又称作琥珀酸，是一种重要的二元羧酸，可以合成多种复杂有机物，在医药、食品、合成塑料、生物可降解材料等领域有广泛的应用。目前化学制备丁二酸的生产工艺相对成熟，但存在能耗高、污染大、产率和纯度不高、依赖石化资源等缺点，抑制了其作为大宗化学品的发展潜力。相比传统的化学合成方法，微生物发酵法利用可再生的生物质资源和CO2为原料，不仅能耗低、污染小，而且开辟了温室气体CO2利用的新途径，是一种高效低耗的新型“绿色化工”生产工艺，成为近年来的研究热点而受到国内外科研人员的关注。本文根据实际生产情况，就发酵法制备丁二酸的生产工艺和其应用前景分别进行介绍。

1 发酵法生产工艺介绍

微生物发酵法制备丁二酸，是利用细菌或其他微生物发酵的方法以淀粉、糖或其他微生物能够利用的废料为原料生产丁二酸及其衍生物的方法[1]。利用生产菌株的生物酶，经生化反应途径将糖类物质代谢合成丁二酸产物。生产过程主要采用生物发酵技术和分离纯化技术。

1.1 发酵菌种

菌种选择是发酵法的关键步骤，直接影响丁二酸的收率、产率和提纯过程。在自然界中，一些厌氧微生物的代谢过程可以产生丁二酸，如许多胃肠和瘤胃细菌以及一些真菌等。天然菌株产丁二酸的能力较低，发酵产物较多，耐糖和耐酸性较差，不利于工业化生产。利用野生菌株进行高效菌种培育是丁二酸发酵菌种选育的重要研究内容，研究热点目前主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌[2]（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、产琥珀酸放线杆菌[3]（Actinobacillus succinogenes）、产琥珀酸曼氏杆菌[4]（Mannheimia succiniciproducens）和大肠杆菌（Escherichia coli）等方面[5-6]。

如GLASSNER D A等[7]筛选出产琥珀酸厌氧螺菌自发突变株FA-10，其发酵产物中丁二酸与乙酸的物质的量之比由4∶1提高至8∶1，最高耐受初始糖度为60 g/L，最优初始糖度为30～50 g/L。在最优发酵条件下丁二酸的产量可以超过30 g/L，得率超过70%。GUETTLER M V等[8]筛选出产琥珀酸放线杆菌的抗氟代乙酸的变异株，在最适条件下，丁二酸产量达到110 g/L，发酵时间48 h，得率高达97%，这是目前已报道的丁二酸发酵中的最高产量。LEE J等[9]筛选出一株产琥珀酸曼式杆菌LPK7，几乎无甲酸、乙酸和乳酸等副产物，丁二酸产量可以达到52.49 g/L，丁二酸收率和产率分别达到1.16 mol/mol，1.8 g/（L·h），这是目前已报道该菌种产丁二酸的最高水平。

近年来，对大肠杆菌的基因工程和代谢工程的基础研究比较深入，其易于培育、生产迅速，能够采用分子生物学技术对其进行改造，成为基因工程菌研究的热点。采取加强代谢过程中的关键酶、敲除或失活竞争途径中的其他酶、引入新的代谢途径等基因改造策略，使重组大肠杆菌成为产丁二酸的优秀菌株。马江锋等[10]以大肠杆菌JM001为出发菌株，敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，并将枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶导入，构建了重组菌株JM002，该重组菌株经过有氧阶段生长菌体、厌氧阶段发酵固碳，积累高浓度丁二酸后，丁二酸收率可达86%，副产物积累很少。SANCHEZ A等[11]通过敲除乳酸、乙酸、乙醇等副产物生成途径的相关基因，激活乙醛酸循环途径，得到菌株SBS550MG，使得丁二酸的收率达到1.60 mol/mol。

1.2 发酵工艺

廉价的原料来源是工业化发酵生产丁二酸的重要保证。以玉米[12]、糖蜜[13]、木薯[14]等可再生生物质资源或者利用废弃或廉价的农林生物质资源（如木材水解物[15]、秸秆水解液[16]、乳清[17]、玉米芯[18]和玉米籽皮[19]等），作为菌株生产、发酵的糖源，既可以得到安全的食品、医药级产品，又可以有效降低生产成本，还可以更好地解决农业废弃物的处理问题。

丁二酸的发酵工艺是典型的厌氧发酵，二氧化碳在发酵菌株的代谢过程中起着非常重要的作用。发酵固碳机理见图1。

图1 丁二酸生产菌株发酵固碳机理Fig.1 Mechanism of carbon sequestration of succinic acid fermentation strain

丁二酸的产生途径主要为两条：（1）葡萄糖转化成磷酸烯醇式丙酮酸，由于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是一种固定CO2的酶，在CO2存在的情况下，该酶将磷酸烯醇式丙酮酸催化生成草酰乙酸，然后被后续的其他酶转化为苹果酸、富马酸，最终以丁二酸的形式积累。此途径是丁二酸的主要生成途径。（2）葡萄糖生成磷酸烯醇式丙酮酸后，在丙酮酸激酶的作用下转化为丙酮酸，由于人为阻断了丙酮酸转化为乳酸、乙醇和乙酸等产物的代谢途径，大量积累的丙酮酸在苹果酸酶的作用下转化为苹果酸后，再转化为富马酸，最终生成丁二酸。通过以上两条途径，生产菌株将葡萄糖最终全部代谢转化为丁二酸。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是产生丁二酸的主要生化反应的关键酶和限速酶，它受CO2浓度的影响和调控较为突出，较高的CO2浓度可以提高磷酸烯醇式丙酮酸的活性，有利于厌氧环境的维持和丁二酸的产生。有研究表明，二氧化碳和葡萄糖的摩尔比为1∶1时，葡萄糖发酵液以丁二酸为主要产物[20]。因此当前对发酵工艺的研究主要集中于使发酵菌株在代谢过程中最大限度地利用二氧化碳。研究者大多采用连续不断地通入CO2的方法，提供厌氧发酵的环境，保证菌株固碳效果。同时，在培养液中加入少量的营养物质和金属盐，可以提高菌株的生产速率和丁二酸的产率。如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在Mn2+、Co2+、Mg2+影响下能表现出最大的活性[21]，可以有效促进丁二酸的生成。

丁二酸的最佳发酵过程在中性条件下进行。由于酸的产生会降低pH值，不利于菌株的生长，导致碳源的利用率下降，因此需通过加碱来调节pH值。如DATTA R等[22]添加氢氧化钙调节发酵液的pH值，在发酵过程中同时结晶出丁二酸钙；梁丽亚等[23]通过5 mol/L NaOH外源流加调节发酵液的pH值至7.0；谢鑫等[24]和白雪飞等[25]通过加入MgCO3来控制发酵过程中的pH值。在实际生产中，Na2CO3、MgCO3等强碱弱酸盐中和发酵液有以下优点：CO32-水解反应后既可以提供OH-，调节发酵液的pH值；水解出的CO2又可以为菌株的发酵过程提供碳源。

1.3 分离纯化

发酵产物中含有有机酸盐，发酵液中的细胞残骸、蛋白质等不溶物质需要从产品中除去。因此，分离纯化的过程就是除去不溶性杂质，将丁二酸盐转化为游离的丁二酸，并将其浓度提高到所需要的过程。一种路线短、成本低、无污染、操作简便的分离提取工艺对于工业化发酵生产丁二酸是非常关键的。

目前研究的几种提取工艺有液-液萃取法、钙盐结晶分离法、电渗析技术、硫酸铵裂解分离法和膜分离法等。各种提取方法的比较见表1。

表1 各种丁二酸提取方法的比较Table 1 Comparison of various kinds of succinic acid extraction method

1.3.1 液-液萃取法

液-液萃取法是从发酵液中提取有机酸的经典方法。赵洪等[26]以20%三烷基胺（7301）、30%正辛醇、50%煤油为混合溶剂，对丁二酸稀溶液进行络合萃取，可取得满意的分离效果。吴昊等[27]发明一种以酯类溶剂为萃取剂，从丁二酸发酵液或结晶母液中萃取分离丁二酸的方法。先将发酵液或结晶母液进行预处理，再与萃取剂进行液液萃取；待萃取分层分离后，将萃取相通入蒸馏塔，并将水通入蒸馏塔中进行蒸馏反萃取，塔顶得到的酯类溶剂经冷却后作为萃取剂循环使用，塔底得到的丁二酸水溶液经结晶得到丁二酸，该方法具有萃取过程简单、分离效果不受料液中盐的种类和浓度的影响、丁二酸回收率高、萃取余相中的无机盐可回收的优点。液-液萃取法是化学工业中一种效果良好、应用广泛的方法，但提取过程中使用了大量有机溶剂，残留溶剂的毒性影响了其在医药食品行业的应用[28]，同时该法不适合高离子强度的发酵液体系。

1.3.2 钙盐结晶分离法

钙盐结晶分离法是在发酵过程中添加氢氧化钙调节pH值，并在发酵过程中结晶出丁二酸钙，通过过滤、清洗，除去沉淀中的蛋白和菌体等物质，再将晶体加入浓H2SO4中，生成可溶的丁二酸和不可溶的硫酸钙，游离的丁二酸通过过滤、活性炭或离子交换树脂纯化，再结晶成纯丁二酸晶体[22]。该方法会产生大量的不适合商业用途的石膏副产物，并且需消耗大量硫酸、CaO或Ca（OH）2，且不能循环利用。

1.3.3 电渗析技术

电渗析技术是一种高效膜分离技术，利用阴阳离子交换膜的选择透过性，在电场力的作用下，将发酵液中的丁二酸根和H+分别分离出来，结合生成丁二酸。用NaOH中和的发酵液中含有丁二酸钠，除杂后的丁二酸钠溶液送入分批的两级膜电渗析单元。丁二酸钠溶液电解为丁二酸，在阳极膜处钠离子与氢氧根结合生成氢氧化钠，可将其重新用于发酵罐中的中和反应。最后，通过蒸发结晶器将丁二酸溶液浓缩结晶。该方法的缺点是操作路线长，能耗高，具有不能处理二价离子的局限性，且设备投资较大。

1.3.4 硫酸铵裂解分离法

YEDUR S等[29]提出了一种不消耗大量试剂，也不产生大量副产物的生产和纯化丁二酸的工艺，生产过程中的副产物硫酸铵可实现循环利用。先用氨来调节发酵液的pH值至7.0，生成6%～10%的丁二酸二铵稀溶液，过滤浓缩后，将丁二酸二铵用硫酸或硫酸氢铵酸化为丁二酸和硫酸铵，并在低pH值条件下结晶。结晶液过滤洗涤后通入纯甲醇中，由于丁二酸可溶于甲醇，硫酸铵相对不溶，可将丁二酸从一些共结晶的硫酸盐中分离出来。丁二酸和甲醇混合液中的甲醇可通入蒸发器中蒸发分离，从而产生纯的丁二酸结晶，蒸发的甲醇可收集贮存于甲醇贮罐中以便循环使用。滤出的硫酸铵与其他硫酸盐进入热分解器中，硫酸铵在200～310℃条件下裂解成氨和硫酸氢铵或硫酸。氨可加到发酵液中调节pH值，硫酸氢铵和硫酸可用于丁二酸的酸化结晶，从而形成一个闭合的清洁生产过程，丁二酸晶体是唯一的产物，但此结晶过程操作条件比较苛刻，步骤繁琐，难度较大，还未能应用于实际生产中。

1.3.5 膜分离法

膜分离法是以压力差为推动力，根据粒径大小分离溶液中所含大分子和微粒的分离操作，是一种简单的物理分离过程。姚忠等[30]将丁二酸发酵液先加水稀释，用微滤膜过滤去除菌体和其他杂质颗粒，再用超滤膜过滤除去发酵液中的蛋白等大分子物质，利用活性炭的吸附作用，除去色素等小分子杂质及残余蛋白，得到澄清的丁二酸溶液，减压浓缩、结晶后得到丁二酸产品。该方法条件温和、操作简便、成本低、选择性好，但此法的关键是选择合适孔径的耐酸膜，由于膜易堵塞，所以膜分离法作为一种预处理手段，一般用来截留发酵液中的有机大分子（如糖、蛋白质、原料颗粒等），减轻后续提纯工序的难度。

2 丁二酸的应用

图2是以丁二酸为中间物的基础化学品和专业化学品的合成路线图。发酵法生产的丁二酸由于污染少、纯度高、成本低，为下游产品大量生产提供了可行性；另外，由于生物法制备的丁二酸不含有害金属离子，可以保障在食品、医药行业上应用的安全性。丁二酸主要应用于以下方面：

2.1 化学品领域

丁二酸的主要传统市场：（1）表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂应用于轻工业；（2）离子螯合剂应用于电镀行业，防止金属的溶蚀和点蚀；（3）应用于纺织加工行业，改进己内酰胺黏度与防火性，改进染色性等[31]；（4）作为其他化学制品的原料，如1,4-丁二醇，γ-丁内酯、四氢呋喃、己二酸等。

图2 以丁二酸为基础的化学制品Fig.2 Chemical products based on succinic acid

丁二酸作为生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（poly butylenes succinate，PBS）的主要原料，具有良好的前景市场。巴斯夫公司、三菱公司、清华大学、中科院理化研究所都已成功开发以丁二酸为原料合成PBS的技术，并开始批量生产。PBS相对于其他生物可降解塑料，力学性能优异，耐热性能好，可利用现有塑料加工设备进行加工，产品性价比高，市场需求量大。分析认为，未来我国PBS的年需求量将超过300万t，每生产1 t PBS需要消耗0.62 t丁二酸，预测我国丁二酸的年需求量将超过180万t，目前国内丁二酸的产能不足5万t/a，市场增长空间巨大[32]。

2.2 食品领域

丁二酸可作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂等[20]。丁二酸二钠（干贝素）具有贝类的鲜味，广泛应用在啤酒、香肠、火腿、方便面、膨化食品中，也用来改善酱类食品、炼乳产品以及调料的质量。赖氨酸残基的丁二酸酰化能提高食品中大豆蛋白质的物理和功能属性；丁二酸的衍生物辛烯基丁二酸淀粉酯，作为一种安全性较高的乳化增稠剂，在罐头食品、酸奶、奶酪、软饮料、粉末香精等加工过程中起着稳定和增稠的作用[33]。

随着食品安全受到国人越来越多的重视，国家也更加规范调味添加品的使用。由于化学法生产的丁二酸含有微量的杂质，限制了其在食品行业的应用，微生物发酵法生产的丁二酸则完全满足要求，应用前景看好。

2.3 医药领域

丁二酸在合成解毒剂、利尿剂、止血药、维生素及合成抗生素方面有较大的作用[34]。如维生素E丁二酸酯能够促进维生素A吸收、改善细胞营养供给，增强机体对营养的利用，具有独特的抗癌保健功能及免疫调节作用，在医药领域研究方面受到重视；美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）于2013年批准了目前唯一一种治疗女性孕吐的药物，其有效成分为丁二酸多西拉敏。

3 展望

丁二酸可取代许多苯基中间产物，减少苯基化工产品在生产和消费中造成的污染。虽然丁二酸和其大多数衍生物还处于进一步研究和发展阶段，但其代替苯和石油等化工原料的前景非常广阔。据预测，2011～2018年丁二酸的全球市场将从2.403亿美元增长至8.326亿美元，2018年产量将超过25万t。生物基丁二酸的消费需求也将进一步促进未来丁二酸的消费市场。

发酵法制丁二酸，通过筛选优良的菌种，利用廉价的原料，经过合理的过程优化，生产出更具优势的丁二酸产品。发酵法作为化石原料的替代工艺正逐渐兴起，对国防和能源市场具有重要的战略意义。因此美国能源部将丁二酸列为12种最有潜力的大宗生物基化学品的第一位，联合四个国家级实验室进行丁二酸的生物转化和提取攻关计划。

目前，帝斯曼、巴斯夫、麦里安科技公司、生物琥珀公司等国外公司已兴建多个世界级生物基丁二酸工厂。如Reverdia公司已于2012年投入运营1万t/a的全球首套大型生物基丁二酸生产装置。我国现有丁二酸生产企业十余家，大部分以石油基为原料且生产规模不大，以微生物发酵为基础的生产工艺才刚刚起步，2013年中石化扬子石化公司1 000 t/a生物发酵法制丁二酸中试装置建成并试生产，标志着国内生物发酵制丁二酸的工艺研究向工业化生产方向迈进。通过开发新的发酵原料，优选生产菌株，改进发酵和分离工艺，使丁二酸发酵技术向着更节能、更环保、更高效的方向发展。

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Production process of succinic acid by biological fermentation

WEI Shikang

(Chemical Plant,Sinopec Yangzi Petrochemical Co.,Ltd.,Nanjing 210048,China)

Succinic acid is an important chemical material.It is widely used in food,medicine and chemical industry,and has broad market prospect. The process of succinic acid fermentation is a new type of green chemical production process and has the characteristics of high efficiency,environment friendly and sustainable utilization.In this paper,the microbiological fermentation technology of succinic acid was introduced,and the application prospects of succinic acid were also analyzed.

succinic acid;biological fermentation;technology;application

TQ921

A

0254-5071（2014）11-0015-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.004

2014-09-18

中石化科研项目（No.K11GKC002）

魏世康（1982-），男，助理工程师，本科，主要从事化工生产技术管理工作。