传统发酵豆豉蛋白质生物学变化与抗氧化能力研究

李雨枫，欧阳晶，苏悟，郑小芬，蒋立文

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南长沙410128）

传统发酵豆豉蛋白质生物学变化与抗氧化能力研究

李雨枫1，2，欧阳晶1，2，苏悟1，2，郑小芬1，2，蒋立文2，3*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南长沙410128）

选取15种具有地区代表性的豆豉，测定总酸含量、水解度、水溶性蛋白含量、酸溶性蛋白含量、褐变指数及总抗氧化能力等指标，利用描述性分析结合主成分分析、聚类分析对样品进行评价。结果表明，15种豆豉样品在质量指标上差异性很大，其中中南地区样品在指标上优于西南地区样品；细菌型豆豉在酸溶性蛋白及水溶性蛋白含量上优于霉菌型豆豉，干豆豉与湿豆豉在质量指数上差别不大。主成分分析及聚类分析表明各质量指标与抗氧化性的关联性从大到小依次为褐变指数＞总酸含量＞水解度＞水溶性蛋白含量＞酸溶性蛋白含量，干豆豉与细菌型豆豉在蛋白水解程度上要优于其他豆豉，而后发酵时间是影响豆豉总抗氧化能力的主要因素。

豆豉；抗氧化肽；变异系数；聚类分析；主成份分析

豆豉是一种以黑豆或黄豆为原料利用微生物发酵制成的传统调味品，以其风味独特、口感鲜香而深受人们的喜爱[1]。豆豉发酵过程中，微生物分泌蛋白酶将大豆中的蛋白质酶解成为小分子蛋白、肽及氨基酸，不仅大幅提高了蛋白体外消化率[2]，同时赋予豆豉各种功能性特征[3-4]。

大豆抗氧化肽（soybean antioxidant peptide）是大豆蛋白水解产物中含有抗氧化功效的肽成分，是豆豉中含有的功能性成分之一[5]，其除了具备溶解度高、黏度低、稳定性好[6]等优点外。还具有良好的对抗自由基的能力[7]。我国是豆豉的发源地与主要的消费国，但由于发酵中优势菌种、发酵工艺等因素各异，加之各地区自然条件、饮食习惯的不同，成就出各类不同品种的豆豉。如今对于大豆抗氧化肽制备方法的研究主要集中在可控酶解领域[8-9]及发酵领域[6]，而对于从发酵食品中提取的研究较少。调查不同地区豆豉的蛋白质生物学变化与抗氧化能力有助于提升发酵大豆制品的营养保健功能，为不同工艺豆豉之间保健特性的可能差异提供依据。

本实验选取15种具有地区代表性的豆豉，测定其总酸含量、水解度、水溶性蛋白含量、酸溶性蛋白含量、褐变指数及总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）等指标，采用描述性分析法、主成分分析法与聚类分析法进行对比，筛选出各质量指标与总抗氧化能力最好的豆豉，以期为优化豆豉生产工艺，提升发酵大豆制品营养功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从市场上采购来自全国各地的15种豆豉样品，实验过程中样品均在保质期内，具体样品名称、产地等特性见表1。

表1 豆豉的基本情况介绍Table 1 Basic situation of Douchi

传统发酵豆豉的生产地与消费地主要集中在我国西南、华中、华南一带，本试验选取豆豉包括优势菌种为细菌型3种、霉菌型12种；按区域划分共有华中区4种、华南区2种、西南区7种、华北区1种、国外1种。因此本试验所采样品在一定程度上可以代表传统发酵豆豉种类。

酚酞、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、四硼酸钠、硼酸、甲基红、溴甲酚紫、中性甲醛、磷酸二氢钾、丙酮、三氯乙酸、乙醇，均为分析纯：由国药集团化学试剂有限公司；总抗氧化性（T-AOC）试剂盒：南京建成生物工程研究所；混合纤维素脂（水系）微孔滤膜（孔径0.22 μm）：上海兴亚净化材料厂。

1.2 仪器与设备

CP214分析天平：上海奥豪斯仪器有限公司；7200可见分光光度计：上海尤尼科仪器有限公司；GL-3250磁力搅拌器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司提供；KDN-103F自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆豉粗蛋白提取方法[11]

称取25 g豆豉样品，加入2.6倍质量的丙酮，在冰水浴的条件下磁力搅拌30 min，放置在-18℃的冰箱中静置1 h，然后4℃、10 000 r/min离心30 min，去除上清液，再次加入2.6倍质量的丙酮、-18℃静置1 h，离心，重复一次，得到的固体转移至干燥托盘中，45℃干燥2 h去除丙酮，再经冷冻干燥，得到豆豉粗蛋白。

1.3.2 分析检测方法

样品中总酸含量的测定采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法；氨基酸态氮含量的测定采用GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》按照甲醛值法；总氮含量的测定采用GB/T 5511—2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法》中的凯氏定氮法。样品水解度的计算公式如下：

样品中褐变指数的测定[10]：依照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》对各豆豉原样中的水分进行测定，然后称取2～3 g豆豉原样，加入50 mL体积分数为50%的乙醇溶液，密封50℃振荡1 h，定性滤纸过滤，滤液以1∶9比例稀释，稀释液在波长420 nm处测定吸光度值，以水分含量为指标换算成干基豆豉吸光度值。

粗蛋白中水溶性蛋白含量测定采用NYT 1205—2006《大豆水溶性蛋白含量的测定》中的凯氏定氮法进行；粗蛋白中酸溶性蛋白含量测定采用GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中的酸溶性蛋白测定方法进行；粗蛋白中总抗氧化能力测定按照总抗氧化性（T-AOC）试剂盒说明书进行。

1.3.3 数据分析处理办法

利用SPSS V19.0软件，以15种豆豉各质量指标值为参数进行描述性统计分析、主成分分析与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 豆豉质量指标统计分析

测定豆豉原样中总酸含量、水解度、褐变指数与豆豉粗蛋白中水溶性蛋白、酸溶性蛋白、总抗氧化能力，结果如表2所示。

总酸含量直接影响了豉醅中各种酶的活性，并且不同酸度对微生物种类及发酵代谢也有影响[12]；发酵过程中蛋白质经酶解暴露出亲水基团或解离成小分子水溶性物质（肽、氨基酸等）均会造成蛋白水溶性、酸溶性与水解程度增加[13]，因此水解度、水溶性蛋白含量与酸溶性蛋白含量从一定程度上能代表豆豉中蛋白的解离程度；豆豉的褐变不仅由豆豉保温后发酵阶段羰基与氨基化合物发生美拉德反应所产生的高分子类黑金物质所造成，同时也与发酵体系内一些低分子质量有色化合物和类黑精物质有关[14]，并且多肽与豆豉颜色的变化即黑色素的形成具有一定的联系[15]。然而抗氧化肽的抗氧化性与产物中肽含量及其分子质量大小（即蛋白的水解程度）具有明显关联性[9]，因此本实验所检测的各指标均与抗氧化性具有一定的联系。由表2可知，各豆豉质量指标数值较为离散，无法直观分析样品间差异，因此，将各豆豉质量指标进行描叙性分析、主成分分析、聚类分析。

表2 豆豉原料的质量指标Table 2 Quality indexes of Douchi material

2.2 豆豉质量指标的变化

各种不同豆豉质量指标及变异系数见表3。

从表3可知，各类豆豉总酸含量均值为（20.34±7.54）g/kg、水解度为（20.54±9.87）%、褐变指数为（0.241±0.173）、水溶性蛋白含量为（18.75±5.49）g/100 g、酸溶性蛋白为（16.66± 4.96）g/100 g、总抗氧化能力为（1.801±0.737）U/mg；各类豆豉因产区、优势菌种与水分含量不同造成其品质各异。从发酵中优势菌种上来看，霉菌型豆豉在总酸含量、褐变指数、总抗氧化能力方面要优于细菌型豆豉，而细菌型豆豉的水溶性蛋白含量与酸溶性蛋白含量较高。相比霉菌型豆豉，细菌型豆豉发酵初期，诸如纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等细菌菌体增殖快[16]，代谢旺盛，产生了大量的蛋白酶，有助于水溶性蛋白与酸溶性蛋白的积累[17]；而霉菌型豆豉一般后发酵时间较长，加之高盐条件为耐盐产酸微生物生长营造了良好的环境[18]，这可能是造成总酸含量较高的原因。并且长时间的后发酵有利于类黑精等褐变物质的累积[19]，使得褐变指数的增加。从豆豉水分含量上来看，两类豆豉的质量指数差别不大，湿豆豉在总酸含量、褐变指数与总抗氧化能力方面略高于干豆豉。干豆豉的制作一般于后发酵完成后进行干制，控制了豆豉的水解程度，并且含水量较低不利于各类微生物的代谢及产生酶的作用[20]，这可能是干豆豉在总酸含量与褐变指数较湿豆豉低的原因。从产地上来看，中南地区豆豉在各质量指标上均比西南地区豆豉均值高，且中南地区豆豉变异系数较小，说明其在质量指标上更为接近。中南地区豆豉均为霉菌发酵，且以湿豆豉为主，西南地区豆豉在优势菌种与干湿度上呈现多样化，这些因素都有可能造成其质量指标上的差异。

表3 豆豉质量指标变幅及变异系数Table 3 Quality indicator variable amplitude and variable coefficient of Douchi

变异系数（coefficient of variation，CV）是描述随机变量的离散程度的指标，能反映各种豆豉在同一指标上的差异性[21]。从表3可知，总豆豉变异系数从大到小依次为褐变指数＞水解度＞总抗氧化能力＞总酸含量＞酸溶性蛋白含量＞水溶性蛋白含量；各指标变异系数均＞10%，其中除水溶性蛋白含量与酸溶性蛋白含量外其他指标变异系数均＞30%，褐变指数变异系数＞70%，这说明各类豆豉在质量指标上有较大的差异性。

2.3 主成分的确定

以各类豆豉质量指标为变量，由表3的相关矩阵，通过使用主成分分析法计算该矩阵的特征值[22]，得到特征值和方差分析结果见表4。

表4 主成分的特征值以及贡献率Table 4 Characteristic values of principal component and contribution rates

由表4可知，就各主成分对豆豉质量指标变异的解释，第一主成分能解释所有豆豉质量指标变异的57.579%，第二主成分能解释25.908%，且两者特征值均＞1，总贡献率＞80%。说明两个主成分已能够客观的反映各豆豉质量指标的变异，所以SPSS选择两个主成分：主成分1与主成分2。

图1 聚类分析图Fig.1 Dendrogram of cluster analysis

由图1可知，所有的质量指标均在主成分1的正象限，水解度、水溶性蛋白含量与酸溶性蛋白含量远离坐标中心，说明主成分1主要以三者的影响即蛋白质的解离程度影响为主；而总抗氧化能力、褐变指数、总酸位于主成分2的正象限，水解度、水溶性蛋白及酸溶性蛋白含量处于负象限，总抗氧化性远离坐标中心，说明其主要代表主成分2；载荷图中各质量指标所示坐标与总抗氧化性坐标的直线距离代表了其与抗氧化性的关联性，距离越短说明关系越为接近。由图1可知，各质量指标与抗氧化性的关联性从大到小依次为褐变指数＞总酸＞水解度＞水溶性蛋白含量＞酸溶性蛋白含量。水解度、水溶性蛋白含量与酸溶性蛋白含量三者坐标临近，说明它们有很强的联系。

采用SPSS软件对各豆豉质量指标与总抗氧化能力进行聚类，采用欧氏距离和Ward的方法计算，可以得到聚类分析树状图，结果见图2。由图2可知，所有的质量指标均在主成分1的正象限，水解度、水溶性蛋白含量与酸溶性蛋白含量远离坐标中心，说明主成分1主要以三者的影响即蛋白质的解离程度影响为主；而总抗氧化能力、褐变指数、总酸位于主成分2的正象限，水解度、水溶性蛋白及酸溶性蛋白含量处于负象限，总抗氧化性远离坐标中心，说明其主要代表主成分2；按照三聚类（立方聚类标准，伪F和伪t2）法则，所有的最有分组数为3[23]，即为10时，分为组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。组分Ⅰ的豆豉均为来自中南部的霉菌型干豆豉，均为总抗氧化能力较高的品种；组分Ⅱ以湿豆豉为主；组分Ⅲ包含了大多数西南部的豆豉及细菌型豆豉。

图2 主成分载荷图Fig.2 Load diagram of principal components

利用SPSS对各豆豉质量指标与总抗氧化能力进行主成分得分分析，结果见图3。由图3可知，主成分1解释的主要是蛋白水解程度的变异，主成分1的正象限包括所有干豆豉与所有的细菌型豆豉种类。干豆豉蛋白水解程度高可能是干豆豉后发酵时间长[24-25]，蛋白在酶的作用下得到充分的降解的结果。而细菌型豆豉水解程度高的原因可能是细菌相较霉菌在发酵初期菌体增殖快，代谢旺盛[16]，引起蛋白质降解所造成的。主成分2解释的主要是总抗氧化能力的变异，主成分2的负象限主要是水豆豉（10）、毛霉型水豆豉（1）、纳豆（14）、腊八豆（2）等后发酵时间短的细菌霉菌性水豆豉，而正象限是诸如浏阳豆豉（12）、阳江豆豉（6）等后发酵时间长的霉菌型干豆豉，说明后发酵时间可能与抗氧化肽的总抗氧化能力具有一定的相关性，长的后发酵时间有利于豆豉体系中蛋白酶的充分利用，增加了多肽与寡肽的含量。WU H C等[26]报道蛋白水解产物抗氧化性与肽含量变化趋势相同，这可能就是后发酵时间长能增强豆豉抗氧化性的原因。综合各豆豉的主成分得分，4号湖南风味豆豉在主成分1得分与主成分2得分合计最高，说明其具有良好的质量指标与抗氧化性。

图3 主成分得分图Fig.3 Score of principal components

3 结论

选取15种具有地区代表性的豆豉，测定总酸含量、水解度、水溶性蛋白含量、酸溶性蛋白含量、褐变指数及总抗氧化性（T-AOC）等指标，利用描述性分析与变异系数分析得到15种豆豉样品在质量指标上差异性很大，其中中南地区样品优于西南地区样品；细菌型豆豉在酸溶性蛋白及水溶性蛋白含量上优于霉菌型豆豉，干豆豉与湿豆豉在质量指数上差别不大。

利用聚类分析得到三个组分。组分Ⅰ的豆豉均为来自中南部的霉菌型干豆豉，且均为总抗氧化能力较高的品种；组分Ⅱ以湿豆豉为主；组分Ⅲ包含了大多数西南部的豆豉及细菌型豆豉。说明这些豆豉在一定的方面具有相似性。

利用主成分分析法对豆豉的各质量指标进行分析，从载荷图中可知，主成分1主要以水解度、水溶性蛋白及酸溶性蛋白含量的影响即蛋白质的水解程度影响为主，主成分2主要以总抗氧化能力值的影响为主，各质量指标与抗氧化性的关联性从大到小依次为褐变指数＞总酸＞水解度＞水溶性蛋白含量＞酸溶性蛋白含量；从主成分得分结果可知，干豆豉与细菌型豆豉在蛋白水解程度上要优于其他豆豉，后发酵时间是影响豆豉在总抗氧化能力与褐变指数的主要因素。

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Protein biological changes and antioxidant capacity of traditional fermented Douchi

LI Yufeng1,2,OUYANG Jing1,2,SU Wu1,2,ZHENG Xiaofen1,2,JIANG Liwen2,3*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China; 3.Fermented Food Engineering and Technology Research Center of Hunan Province,Changsha 410128,China)

The 15 kinds of Douchi with regional representation were chosen in the test,to determine the total acid content,the hydrolysis degree,soluble protein content,acid soluble protein content,browning index,total antioxidant capacity and other indicators.The samples were evaluated by descriptive analysis combined with principal component analysis and cluster analysis.The results showed that there were the significant differences in quality indicators between each kind of Douchi samples.The samples from central south region were better than that from the southwest;in the aspect of the acid soluble protein and soluble protein content,bacteria-fermented Douchi was better than mold-fermented Douchi.There was no significant difference in quality between dry and wet Douchi.Principal component analysis and cluster analysis showed that the correlation in quality indicators and oxidation resistance in order was browning index,total acid content,hydrolysis degree,water-soluble protein content,acid soluble protein content.Referring to the protein hydrolysis degree,dry Douchi and bacteria-fermented Douchi were better than the other kinds,and post-fermentation time was the main factor affecting the total antioxidant capacity of Douchi.

Douchi;antioxidative peptide;variation coefficient;cluster analysis;principal component analysis

TS255.54

A

0254-5071（2014）11-0020-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.005

2014-09-17

国家自然科学基金项目（31371828）

李雨枫（1993-），男，本科生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：蒋立文（1968-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。