挤压芝麻粕酿造酱油的制曲参数对中性蛋白酶活力的影响

曹燕飞，成晓苑，王一冉，李宏军

(山东理工大学 农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049)

挤压芝麻粕酿造酱油的制曲参数对中性蛋白酶活力的影响

曹燕飞，成晓苑，王一冉，李宏军*

(山东理工大学 农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049)

以芝麻粕及面粉膨化物为原料进行制曲，选择制曲温度、制曲时间、辅料比例、润水比例4个因素为制曲工艺参数，以中性蛋白酶活力为考察指标，通过四因素五水平二次旋转正交组合试验设计，利用SAS 9.1软件对试验数据处理分析，可以得到最佳制曲参数：制曲温度为33 ℃，制曲时间为42 h，辅料比例为28%，润水比例为95%。在此参数下，膨化物种曲的中性蛋白酶为8132 U/g干基。

制曲；挤压；芝麻粕；中性蛋白酶活力

长期以来，酿造酱油一般是以大豆或豆粕等为蛋白质原料，以面粉、麸皮为辅料，经微生物发酵，制作出富含多种氨基酸、糖类、醇类、酯类、酚类等香味物质的调味品[1]。目前国内已经开始对豆粕、花生粕酱油进行研究，而对芝麻粕酱油的研究甚少。芝麻粕是生产芝麻油后的副产物，一般为深褐色[2]，其蛋白质含量为 42.5%～47.9%，钙和磷的含量也比豆饼、棉籽饼高3～5倍[3]。芝麻饼粕中还含有丰富的必需氨基酸、木酚素、维生素B以及部分矿物质等[4]。

采用低温挤压膨化技术来对芝麻粕原料进行预处理，可以使原料的结构发生改变，一般为蜂窝状或片状[5]。这样的结构利于细菌菌丝朝着原料内部生长, 使淀粉链和肽链主动吸附酶, 增大蛋白酶和淀粉酶含量，有利于酶与原料充分发生相互作用[6,7]，故曲中蛋白酶和淀粉酶含量比常规法高[8]，从而简化了制曲工艺，缩短了发酵周期，提高了酱油的质量[9]。制曲是酿造酱油过程的基础环节，能够为米曲霉创造优良的生长环境[10]，促进曲霉生长发育，并产生后期发酵过程所需要的各种酶[11]。其中，蛋白酶活力是考察制曲好坏的主要指标，根据曲子的蛋白酶活力将原料利用率间接估算出，以及衡量酱油质量等级[12]。

本文利用挤压膨化技术对芝麻粕、面粉混合物进行预处理，以此膨化物为原料进行制曲试验，采用SAS 9.1软件对试验数据进行分析，研究制曲温度、制曲时间、辅料比例、润水比例的制曲工艺参数对膨化物中性蛋白酶活力的影响规律，通过岭回归寻优获得最佳的制曲工艺参数。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料及仪器

芝麻粕 淄博十里香食品有限公司；面粉、麸皮 淄博市面粉厂；沪酿3.042米曲霉 山东巧媳妇食品集团有限公司。

部分式单螺杆挤压机 山东理工大学实验室；UV-1700型紫外分光光度计、AUY-220型电子分析天平 日本岛津公司。

1.2 挤压膨化芝麻粕和面粉等混合物

将面粉比例为26%、物料含水量为21%，与芝麻粕混匀之后进行膨化处理。挤压参数为：模孔孔径6 mm，螺杆转速210 r/min，挤压温度90 ℃。适当地调整切刀转速，使挤出物被切成1～3 mm的薄片，及时放到已灭菌的容器中，冷却后使用。

1.3 膨化物制曲

以米曲霉为种子，制作三角瓶种曲备用。接种到挤压膨化物料中混匀后放到30～34 ℃培养箱中培养17 h进行第1次翻曲，23 h后第2次翻曲，2.5～3天后得到成曲。

1.4 试验方法

以膨化物为原料得到的成曲用福林酶法测得中性蛋白酶活力[13]。试验选择制曲温度、制曲时间、辅料比例、润水比例为试验因素，以中性蛋白酶为考察指标，采用四因素五水平二次正交组合设计来对试验进行安排，制曲试验因素水平编码表见表1。

表1 试验因素水平编码表

2 结果与讨论

2.1 试验安排与结果

根据试验因素水平编码表，应用SAS 9.1软件对考察指标的数据进行分析来探究低温挤压芝麻粕酿造酱油的制曲条件对指标的影响，从而对试验进行安排，试验安排与数据见表2。

表2 试验安排与结果

续 表

注：X1为制曲温度(℃)；X2为制曲时间(h)；X3为辅料比例(%)；X4为润水比例(%)；Y为中性蛋白酶活力(U/g干基)。

2.2 中性蛋白酶活力的响应面分析及结果

利用SAS 9.1.3软件对表2中酱油的中性蛋白酶活力数据进行处理，得到回归方程系数显著性检验、回归模型方差分析以及响应面，见表3、表4、图1～图4。

表3 中性蛋白酶活力的回归方程系数显著性检验表

由表3可知，模型的常数项(Pr<0.0001)极显著；一次项X1(Pr=0.0045<0.01)，X3(Pr=0.0028<0.01)极显著，X3(Pr=0.0306<0.05)较显著；二次项X12(Pr<0.0001)，X22(Pr<0.0001)，X32(Pr<0.0001)和X42(Pr<0.0001)极显著；交互项X2X1(Pr=0.0008<0.01)、X3X2(Pr=0.0001<0.01)和X4X2(Pr=0.0011<0.01)极显著；剩下的项数都不显著。

表4 中性蛋白酶活力的方差分析表

续 表

由表4可知，此模型的决定系数R2为0.9858，线性(Pr<0.0001)、二次项(Pr<0.0001)、交互项(Pr<0.0001)和总回归(Pr<0.0001)均极显著。失拟(Pr=0.2842>0.05)不显著。由此可以说明中性蛋白酶活力的数据与模拟相吻合。

辅料比例28%、制曲时间41 h时，制曲温度和润水比例对中性蛋白酶活力影响的响应面，见图1。

图1 润水比例和制曲温度的响应面分析

由图1可知，当制曲温度恒定时，随润水比的增加中性蛋白酶活力升高，润水比在90%左右时达到最大值，适当的润水比能够提供适合霉菌生长的最适水分活度及含水量。当润水比一定时，中性蛋白酶活力在取值范围内有最大值，即温度在33 ℃左右时酶活力最大，继续升温，蛋白酶活力会随着制曲温度的增加出现下降的趋势。高温导致米曲霉生长缓慢，产生少量的孢子和菌丝，酶的含量也会随之减少[14]。实际生产中，制曲温度控制在30～35 ℃，尽可能不超过40 ℃，否则会出现烧曲现象[15]。

辅料比例28%，润水比例为90%的条件下，制曲温度和制曲时间对中性蛋白酶活力影响的响应面，见图2。

图2 制曲温度和制曲时间的响应面分析

由图2可知，制曲温度低于31 ℃或高于35 ℃时都会影响中性蛋白酶活力，温度在33 ℃时，适合产酶微生物的生长，酶活性最高。制曲时间达到41 h时，中性蛋白酶活力最大，长时间制曲导致蛋白酶失活[16]。

制曲温度33 ℃、制曲时间41 h的条件下，辅料比例和润水比例对中性蛋白酶活力影响的响应面，见图3。

图3 辅料比例和润水比例的响应面分析

由图3可知，当辅料比例一定时，孢子生长随着润水比例的增加而逐渐活跃，酶活力增强，润水比例为90%时，中性蛋白酶活力最高，润水比例继续增加时，挤压物料形成糊状，就会抑制孢子和菌丝的生长，酶活力减弱同时开始出现杂菌，使原料中营养物质被分解，影响成曲的品质[17]。米曲霉为好氧微生物，高含水量的环境会抑制其生长，曲中杂菌大量繁殖产酸导致米曲霉不能够形成优势菌群，影响制曲效果。当润水比例不变时，中性蛋白酶活力随着辅料比例的增大出现先升高后下降的趋势。

制曲温度33 ℃，润水比例90%的条件下，制曲时间和辅料比例对中性蛋白酶活力影响的响应面，见图4。

图4 辅料比例和制曲时间的响应曲面分析

由图4可知，当辅料比固定时，制曲时间过短或过长，都会使酶的活力下降，制曲时间在41 h左右，酶的活力最强。当制曲时间不变时，中性蛋白酶活力随着辅料比例的升高而增加，在辅料比例为28%左右时中性蛋白酶活力达到最大值，辅料比例超过30%时，蛋白酶活力显著下降。这是因为辅料比例低时，由于空隙小使得种曲内溶氧不够充分，导致米曲霉生长迟缓；麸皮比例太高时，米曲霉生长因缺少氮源而受到抑制[18]。

2.3 岭回归寻找最优工艺范围

表5 中性蛋白酶活力的岭回归寻优分析结果

由表5可知，以中性蛋白酶活力为考察指标，经过岭回归选优得到最佳制曲工艺参数范围：制曲温度32～33 ℃，辅料比例23%～28%，润水比例92%～98%，制曲时间41～44 h。

2.4 验证试验安排及结果

在最佳的制曲工艺参数范围内做验证试验，同时以蒸煮法处理的芝麻粕和面粉混合物为原料制曲来做对照试验，结果见表6。

表6 中性蛋白酶验证与对照试验的安排

注：X1为制曲温度(℃)；X2为制曲时间(h)；X3为辅料比例(%)；X4为润水比例(%)；Y为中性蛋白酶活力(U/g干基)。

由表6可知，试验组数据均在较好范围内，所以最终确定制曲参数为：制曲温度33 ℃，制曲时间42 h，辅料比例28%，润水量95%，以挤压处理得到的膨化物进行制曲测得的中性蛋白酶活力在8000 U/g干基左右，最高可达到8132 U/g干基。以蒸煮法处理原料进行制曲测得的中性蛋白酶活力最高为7838 U/g干基。与对照组相比，试验组提高了294 U/g干基。

3 结论

利用挤压膨化技术对芝麻粕、面粉混合物进行处理，以此膨化物为原料进行制曲；以中性蛋白酶活力为考察指标，通过“四因素五水平”二次旋转正交组合试验设计，利用SAS 9.1软件对试验数据处理分析，可以得到最佳制曲参数：制曲温度33 ℃，制曲时间42 h，辅料比例28%，润水比例95%。在此参数下，膨化物种曲的中性蛋白酶活力为8132 U/g干基。

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Effect of Koji-making Parameters on Neutral Protease Activity in Soy Sauce Production with Extruded Sesame Meal

CAO Yan-fei, CHENG Xiao-yuan, WANG Yi-ran, LI Hong-jun*

(School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology, Zibo 255049，China)

Soy sauce koji is produced by extruded mixture of sesame meal and wheat flour as raw materials. koji-making temperature, koji-making time, bran proportion and moisture proportion are the four technological parameters, and use neutral protease activity as index for investigation.Quadratic orthogonal rotating combination design of four factors and five levels is adopted to optimize the parameters of koji making and the data is obtained by SAS 9.1.The optimal conditions are as follows: temperature is 33 ℃, koji-making time is 42 h, bran proportion is 28% and moisture proportion is 95%,under such conditions,the neutral protease activity is 8132 U/g dry basis.

koji making；extrusion；sesame meal；neutral protease activity

2017-02-08 *通讯作者

山东省科技发展计划项目(2013GSF12108)；国家自然科学基金项目(31471676)

曹燕飞(1993-)，女，山东威海人，硕士，研究方向:农产品高值化加工； 李宏军(1968-)，男，辽宁铁岭人，教授，博士，研究方向:食品科学。

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.005

1000-9973(2017)07-0020-05