大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

燕学波，杜运华，吕安林，邢玉洁，胡朝晖，胡新君，岳 峰

近几年自体骨髓间充质干细胞（BMMSCs）移植技术发展迅速，逐渐成为治疗心肌梗死后心衰的有效办法之一。Frieden-stein于1966年首先证实BMMSCs是骨髓基质的重要组成成分，在一定条件下能向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。骨髓是由造血干细胞和非造血干细胞组成，BMMSCs是骨髓的非造血干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，在体外可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等。BMMSCs因取材容易，不涉及伦理问题和无免疫排斥反应，被广泛应用于各种动物实验和临床研究。但是目前尚未筛选出BMMSCs特征性的表面标记分子，因此无法直接鉴定BMMSCs。目前研究发现BMMSCs表达间质细胞、内皮细胞、肌肉细胞等的一些表面标志抗原，而不表达造血干细胞的表面标志抗原。因此可以通过检测BMMSCs阳性和阴性表面标志抗原的方法间接鉴定BMMSCs。主要的分离纯化方法有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪筛选和免疫磁珠筛选。但是4种主要分离纯化方法各有利弊，为此笔者提出，通过密度梯度离心法和贴壁法联合分离纯化BMMSCs，联合细胞形态学变化和检测传代4代的BMMSCs表面阳性标志抗原CD44和表面阴性标志抗原CD45来鉴定BMMSCs。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，体质量（120±20） g，SPF 级，由第四军医大学动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合伦理学标准。

1.2 主要试剂及仪器 L-DMEM培养液，胰蛋白酶，胎牛血清 （FBS），Ficoll淋巴细胞分离液 （1.077 g/ml），FITC标记的抗大鼠 CD44，PE标记的抗大鼠CD45，超净工作台，二氧化碳细胞培养箱，光学倒置相差显微镜，高速室温离心机，流式细胞仪。

1.3 方法

1.3.1 BMMSCs分离、培养及传代 ①采用颈椎脱臼法处死大鼠，在超净台中用不完全培养液彻底冲洗大鼠骨髓腔，获取骨髓悬液；用密度为1.077 g/ml的Ficoll淋巴细胞分离液离心分离出BMMSCs，加入适量L-DMEM完全培养液 （L-DMEM，10%FBS，300 mg/L L-Gln，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素），充分混匀，重悬、计数，以1×106/ml的细胞密度接种于T25无菌塑料培养瓶，随后将培养瓶置于37℃、5%CO2细胞培养箱中饱和湿度培养，3 d后首次更换新鲜L-DMEM培养液，去除未贴壁的悬浮细胞，以后换液1次/3 d，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况，待原代细胞长满培养瓶底85%左右时传代；②待原代细胞接近85%融合时传代，加入2.5 g/L的胰蛋白酶2～3 ml，将培养瓶在倒置显微镜下观察，待细胞间隙增大，回缩变圆时，立即弃去胰蛋白酶，加入适量L-DMEM培养液终止消化，按1∶2的比例将细胞悬液接种于L-DMEM培养基中，第3天首次换液，以后换液1次/3 d，传代细胞记为P1，再次传代细胞记为P2，培养至第4代，进行形态学观察及表面标记抗原鉴定。

1.3.2 BMMSCs的鉴定

1.3.2.1 BMMSCs形态学变化 倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况并拍照记录典型细胞形态。

1.3.2.2 流式细胞仪鉴定 取第4代BMMSCs细胞，用PBS清洗之后加入胰蛋白酶进行消化，制成细胞悬液。将细胞悬液移入离心管中，室温下1500 r/min，离心 5 min。用 PBS 洗涤 2 次，弃上清，余 50 μl，配成浓度为1×106/ml的细胞悬液。分别加入FITC标记的抗大鼠CD44单抗抗体2.5 μl，PE标记的抗大鼠 CD45 单抗抗体 5 μl，4 ℃，避光孵育 30 min。再次用PBS洗涤2次，弃上清液，加入300 μl的PBS，混匀细胞，制成单细胞悬液。将样本上样于流式细胞仪，检测 FITC标记细胞和PE标记细胞各占细胞总数的百分比。

1.4 统计学分析 实验数据采用 SPSS16.0统计软件进行处理，结果以±s表示，两组间均数比较采用t检验。

2 结 果

2.1 BMMSCs培养传代细胞形态学变化 在倒置显微镜下，刚接种的BMMSCs呈圆形或球形，体积小，折光性强（图1a）。3 d后首次换液大部分细胞贴壁，体积较小，形态多样，大部分细胞为椭圆形、短梭形，也有三角形和/或星形细胞，且伸出长短不一、粗细不等的胞质突起互相连接（图1b）。7 d后，细胞快速增殖，形成大小不一的细胞集落，细胞数量明显增多，体积增大，以长梭形为主，呈放射状向四周扩展（图1c）。传代后细胞生长旺盛，呈长梭形、旋涡状生长，且细胞形态均一，趋向一致（图1d）。

图1 BMMSCs培养传代细胞形态变化

2.2 BMMSCs表面抗原鉴定结果 对传至第4代的BMMSCs进行鉴定，采用流式细胞仪检测BMMSCs表面抗原CD44和CD45，结果显示：BMMSCs CD44阳性表达率为（89.98±1.29）%，CD45阳性表达率为（2.14±0.22）%（图2）。此结果与文献报道一致。提示采用联合法分离大鼠骨髓间充质干细胞，经过传代培养扩增，可以得到纯化的BMMSCs。

3 讨 论

BMMSCs是骨髓中的非造血干细胞，主要来源于中胚层，在骨膜、肌肉和外周组织中均有存在，以骨髓和脐血中含量最多，但也只占骨髓有核细胞的0.001%～0.01%。因脐血涉及伦理学问题，且不易采取，故从骨髓中分离、纯化和扩增BMMSCs就显得非常重要[1，6]。 最初 Friedenstein[7]建立 BMMSCs 的分离方法是利用贴壁法分离得到。但随着BMMSCs研究的深入，对细胞需求增加，快速获得足够的BMMSCs是各项研究的基础。目前比较常用的分离纯化方法是贴壁分离法和密度梯度离心法，流式细胞筛选和免疫磁珠分离法因操作繁琐，且易损伤细胞，影响细胞的生物学功能而较少使用。

图2 BMMSCs表面抗原表达

笔者通过充分冲洗大鼠骨髓腔获取最大量骨髓后，用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出单个核细胞，然后利用BMMSCs易于贴壁的特点，通过换液培养去除悬浮不贴壁的细胞。随着培养时间的延长，悬浮不贴壁的细胞随换液而不断被清除，而BMMSCs因贴壁生长得以纯化。通过观察BMMSCs形态学变化和流式细胞仪检测BMMSCs表面阳性和阴性标志物来进行鉴定。从形态学上来鉴别：骨髓造血干细胞多呈圆形，而BMMSCs呈细长梭形，核大，且在培养传代过程中，体积逐渐增大，并形成细胞集落，排列紧密，走向趋于均匀一致。在分离培养的BMMSCs中，虽然含有部分造血细胞，但因其不贴壁悬浮在培养液中，在换液时可以逐步去除，少量造血细胞也能贴壁，但增殖缓慢，在消化传代时脱壁速度比BMMSCs慢，因此通过消化传代的方法也可逐渐将其去除，传至第4代基本可达到纯化目的。

另外一种方法就是通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原间接鉴定BMMSCs。目前研究BMMSCs 表达 CD29、CD44、CD71、CD105、CD166等，而不表达 CD14、CD31、CD34、CD45 等[2-5]。 朱勇等[8]采用直接贴壁法分离培养BMMSCs，通过流式细胞仪检测BMMSCs表面标志抗原CD90、CD45进行鉴定，流式细胞仪检测结果显示第3代BMMSCs表面标记物CD90和CD45阳性表达率分别为99.8%和6.8%，提示BMMSCs表达CD90而不表达CD45。倪玉霞等[9]对全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法分离培养大鼠BMMSCs的纯度进行比较，流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD34、CD44、CD45、CD29、CD90及CD11b。结果显示两种方法分离培养的BMMSCs均表达CD44、CD29和CD90，不表达CD34、CD45和CD11b。密度梯度离心法分离培养出的BMMSCs较全骨髓贴壁培养法纯度高，但全骨髓贴壁培养法能够缩短原代细胞培养时间，提高效率。Zhang等[10]将分离的大鼠BMMSCs利用表面抗原CD54和CD90进行免疫磁珠分选，经流式细胞仪检测证实可以获得高表达CD54和CD90，而不表达CD45的高纯度的BMMSCs。也有研究者采用检测细胞基因的方法来鉴定BMMSCs[11]。

笔者选择检测BMMSCs阳性标志抗原CD44和阴性标志抗原CD45相结合的方式进行鉴定，其结果显示BMMSCs CD44阳性表达率为 （89.98±1.29）%，CD45阳性表达率为（2.14±0.22）%。 此结果与相关文献报道一致。提示采用密度梯度离心法和贴壁分离法联合分离纯化大鼠BMMSCs，经过传代培养扩增，可以得到纯化的BMMSCs。

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