微生物实验室菌种复苏传代保存流程分析

尹桂丽+徐建宝+周燕燕

摘 要：微生物实验室中的菌种管理工作是一件非常重要的工作环节，对微生物实验结果的影响具有非常重要，为提高实验室的工作质量、加强对微生物菌种的保管质量，根据相关工作经验和调查结果对现有的实验室菌种保存及管理模式进行改进，从而形成一个科学、规范、合理的微生物实验室菌种复苏、传代、保存体系是一件非常重要的事情，从而促进我国微生物实验精确度提升，增强相关工程管理质量的规范程度，为我国医药行业发展及生产质量提高创造良好的条件。

关键词：菌种复苏；传代；保存

微生物实验是我国建筑医药研发及生产的重要环节，是确保我国医药研发行业发展的关键基础。根据药典中的标准，微生物实验室对于新引进的培养基需要通过灵敏度测试后才能投入使用；另外，在对无菌实验成果进行检查时需要使用金黄色葡萄球菌作为对比参照，而在对日常灌装环境质量检测时需要使用环境菌进行辅助检验。由此可见，菌种为微生物实验中非常关键的因素，所以必须要建立起一个科学、健全的微生物实验室菌种的复苏、传代及保存体系。

1 用具与设备

接种环，接种针，酒精灯，电热恒温培养箱，生化培养箱，冰箱，灭菌柜，超净台，液氮罐，超低温冰箱，1.5mL冻存管，试管等。

2 菌种的复活

应在环境洁净度D级下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，制备F1，（接收到合适菌种准备使用时，应根据菌种/细胞株的说明书制备复活的培养基对标准菌株、细胞株进行复活。清洁安瓶（可用75%乙醇）后，用砂轮在安瓶的上部1/3处划线，用干燥的无菌纱布包裹安瓶，将安瓶打开。用一无菌吸管吸取0.5-0.8mL适量的液体培养基（生抱梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、短小芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽抱杆菌用胰酪大豆胨液体培养基；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖液体培养基）滴加到安瓶中，轻轻旋转安瓶并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解，再将安瓶内的菌液转移至相应的培养基中，根据菌种类型将其放入适宜的培养条件[需氧菌培养温度（30-35）℃，18-24h；真菌培养温度（20-25）℃，3-5d下培养，观察培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，此为F1，如不浑浊，需氧菌应延长培养时间至5天以上，真菌应延长培养时间至7d以上，仍不浑浊，按121℃，30min条件火菌处理，再对复活后的标准储备菌株进行纯度和特性的确认。

3 菌种的传代

菌种是微生物实验中的重要辅助工具，所以其质量非常重要，每一个菌种在使用前都需要进过严格的测评才能投入实验中。微生物实验是一项对严谨性和精确性要求非常高的工作，所以对于试验中要用到的每一类菌种的复苏、传代和保存都有一套非常严格的标准及原则，已经透过严格检定、确定与相关条件相吻合的菌种才能执行传代步骤。另外，传代工作流程在实际操作时也有非常严格的要求，传代次数不宜过多，且要减少不必要的传代工作，同时还要对传代时的温度进行合理调控。

4 菌种的保藏

在菌种的复苏及传代工作完成后，实验室中的菌种管理工作体系已经进入最后一个环节，这一环节同样是保证菌种质量及功效的重要步骤。而在实验室的当中对菌种进行保藏的方法有很多，下面笔者就对几种实验室中常见的菌种保藏方法进行简要阐述。

4.1 甘油冷冻管保藏法

甘油冷冻管保藏发是在实验室中一种非常常用的保藏手段，该方法的具体操作方法是使用无菌接种环对菌种表面的菌苔进行刮取，然后利用接种环接触试管的方式使细菌通过与试管壁的轻度摩擦向事先准备好的放置于试管内部的无菌蒸馏水中传输，或直接将菌放置于培养基当中，同时还要对菌液的浓度进行调节，然后在调配完成后的菌悬液中添加体积相等、浓度标准是30%的无菌甘油，从而得出15%的甘油菌悬液。在操作过程中要保证所使用的甘油浓度保持在一个较低的程度，如果甘油浓度高于实验标准将会造成细菌细胞渗透压力产生变化，最终导致细菌发生死亡的问题。在细菌传导完成后需要对试管进行振动和摇荡，在摇时要注意对力度的控制，让试管内的各种物质达到充分融合，再将融合后的溶液分别放置于无菌小试管中，最后将制作完成的甘油冷冻管放入-20℃的低温环境中进行预冻处理，并将其放在低于-80℃的超低温环境中存放，且要保证冰箱的温度至少为-30℃，其在这种冷冻环境下通常能够保留的时长为2a，而乙型溶血性链球菌对保存温度的要求较高，在超低温环境下该菌种的可保存时长为3个月。

4.3 斜面低温保藏法

斜面低温保藏法是一种过渡性较强的保藏方法，其保藏时间较短，该方法是通过将菌种转移至条件合适的试管培养基上，或将其转接在茄子瓶的固体培养基斜面上进行培养，在菌种成长到一定程度之后再将其放入2-8℃的温度环境中进行保存。而微生物菌种的类型不同，其保存时间长短也会有所差别。然而，这种保藏方法有一个非常突出的劣势特点，就是采用这种方式进行保存的菌种极易发生状态改变，如果菌种发生变异会对其后期传代效果造成影响，使菌种受到污染。所以，这种方法只能在需要保藏时间较短的菌种类型的保藏工作中使用，并且还要对菌种的保藏状态进行随时检查。

4.4 液氮超低温保藏法

4.4.1 制备菌悬液

将需要保藏的菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，适宜温度培养，当菌落健壮地长满斜面时取出。配制30%的甘油溶液进行121℃下高压火菌30min，将生长良好的菌种斜面用生理盐水制成菌悬液，菌浓度控制在107左右，然后加入等体积甘油水溶液混匀后制成15%的甘油菌悬液。

4.4.2 分装菌悬液

把购买的1.5ml的塑料冻存管拧松管帽置一烧杯中，外扎纱布、牛皮纸包扎好进行121℃高压火菌30min。然后将制备好的菌悬液分装至1.5mL的塑料冻存管中，每支冻存管加入1mL菌悬液，拧紧管帽，并用胶布封口，分别在胶布和冻存管上做好菌种标记。

4.4.3 液氮保藏

将菌液保持在0摄氏度的状态，然后将有关设备放置到零下70摄氏度左右的冰柜立面，然后进行降温。接着将相应的冻存管放入到液氮罐妥善的保存，并且在罐的外面做好详细的标记工作，为以后使用菌种带来方便。当液氮中所存在的菌种需要复苏时，这时操作人员就应当将菌种提出来，放置到大约35-40摄氏度的环境里面进行充分的搅拌，从而达到解冻的目的。为了避免菌种出现污染的情况，操作人员需要用75%的酒精进行擦拭，当表面完全干燥以后就可以使用相应的容器将菌液按种到相应的培养基上做好培养工作。

结束语

综上所述，对微生物实验室中的菌种进行保存的方法有很多种，这些方法的正确使用对菌种的保存质量的提高具有积极作用。然而，若方法使用不合理使菌种的保存质量严重降低，不但无法达到有效提高菌种保存效果的目的，还会造成适得其反的结果，因此一定要建立起科学规范的菌种复苏、传代和保存体系，这样才能有效提高菌种保藏的科学性和规范性，以促进微生物实验室检验效率的提高，增强实验结果的精确性，为微生物实验工作的完善奠定基础，从而推动该行业在我国快速发展。

参考文献

[1]王燦.微生物实验室菌种管理和使用经验探讨[J].生物技术世界，2015（1）：8-8.

[2]陈晓燕，林光.微生物实验菌种保存方式探讨[J].临床合理用药杂志，2014（29）：129-130.