Isolate密度梯度离心法和上游法对精子DNA碎片率及人工授精结局的影响

朱佳，余柯达，陈晓，毛佳婷，杨丽华，邹立波

（金华市人民医院，浙江 金华 321000）

夫精宫腔内人工授精（IUI）目前已广泛应用于不孕不育的治疗，主要适应证为轻度弱精症、不明原因不孕和宫颈性不孕等。在进行IUI时，为了得到更高的临床妊娠率，注入宫腔前需要对精子进行优化处理，目前精子优化的主要方法有密度梯度离心法和上游法。密度梯度离心法可有效去除精液中的杂质，并可回收更多有活力的精子；上游法可得到活力更高的精子，但回收率较低。精子DNA的完整性是父代遗传信息得以准确传递的必要条件，精子DNA碎片指数（DFI）被认为是一种新的、重要的精液质量指标。Bungum等[1]研究结果表明，精子DFI升高会导致IUI的临床妊娠率降低，苏静等[2]和梁嘉颖等[3]的研究结果也与上述结论一致。本研究比较两种精子优化方法对精子DFI的改变及其对人工授精结局的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2018年1月-2019年5月在本院生殖中心首次行IUI的不孕不育夫妇。纳入标准：（1）女方输卵管至少有一侧通畅；（2）无排卵功能障碍；（3）排除内分泌异常及盆腔炎症等。共计328对不孕不育夫妇入选。

1.2 方法 女方采用克罗米芬（CC）或尿促性腺激素（HMG）等进行控制性促排卵治疗。当优势卵泡直径≥18mm时注射绒毛膜促性腺激素（HCG）5000～1000U，24～36 小时后行 IUI，28 天后 B 超检查宫腔，内见孕囊确诊为临床妊娠。男方禁欲3-7天，于IUI当日用手淫法收集精液，液化后留取部分精液，分别经Isolate密度梯度离心法或上游法优化处理后再留取部分精液，用CASA分析精子浓度和精子活力，采用精子染色质扩散实验（SCD）检测精子DFI。随机分为密度梯度离心法组和上游法组，每组164例。处理前根据精子DFI分为DFI≤20%组和DFI＞20%组（注：精子DNA碎片染色安科生物试剂盒说明书中DFI>10%为异常；临床实践中10%20%设为重度异常，对临床结局影响影响较大，故本研究以20%作为DFI的分界）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料用（±s）表示，采用 t检验，计数资料用百分率表示，并采用χ2检验。

2 结果

2.1 精子质量参数 共计328对不孕不育夫妇入组，精液处理前精子DFI≤20%的有200例，DFI＞20%的有128例，再按精子优化方法各分为Isolate密度梯度离心法和上游法。由表1可知，处理前相同精子DFI组中Isolate密度梯度离心法与上游法之间的精子活力、精子DFI差异无统计学意义（P>0.05）。处理后精子活力均显著提高，且上游法显著高于Isolate密度梯度离心法；处理后精子DFI也显著降低（P<0.05），且 DFI>20%中的 Isolate密度梯度离心法显著低于上游法。差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 IUI结局 相同DFI组Isolate密度梯度离心法与上游法的男、女方年龄和不孕年限之间差异无统计学意义（P>0.05）。DFI≤20%中Isolate密度梯度离心法和上游法的临床妊娠率分别为24.00%和26.00%，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。DFI>20%中Isolate密度梯度离心法和上游法的临床妊娠率为15.63%和4.69%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

精子DNA碎片是指精子在生成和成熟的过程中精子DNA完整性被破坏而产生断裂的碎片，是多因素共同作用、精子自身抗损伤机制失衡导致的结果，与精索静脉曲张、生殖道感染、睾丸温度升高、吸烟、激素和环境污染等因素有关[4]。目前精子DFI对体内授精结局的影响较为明确，精子DNA碎片化会造成不育[3，5]和反复流产[6]。在进行IUI时需要对精液进行优化处理，去除精浆、细胞碎片和不活动精子等，特别是精液中的抗精子抗体、前列腺素和异性蛋白等不利于受精的物质，还可得到高存活率、活力且形态学正常的精子。

目前，精子优化的主要方法有密度梯度离心法和上游法，关于两种方法对精子DFI影响目前研究较少。密度梯度离心法和上游法均可显著提高精子DNA的完整性，两种方法差异无统计学意义[7-8]。郑毅春等[9]则认为非连续密度梯度法在筛选DNA完整性高的精子方面比上游法更有效。本研究中作者发现Isolate密度梯度离心法和上游法处理精液后均可显著提高精子活力和降低精子DFI（P<0.05）。且处理后的精子活力，上游法显著高于Isolate密度梯度离心法（P<0.05）。优化后的精子DFI，Isolate密度梯度离心法和上游法在DFI≤20%中差异无统计学意义（P>0.05），与杨俊涛等[8]结论一致，但在DFI>20%中Isolate密度梯度离心法显著低于上游法（P<0.05），与郑毅春等[9]结论一致。之前的研究得出的结论不同的原因可能是由于未对精子的DFI值进行分组。

表1 不同精子优化法对精液质量参数的影响（%）

表2 不同精子优化法对IUI结局的影响

本文中不同精子优化方法对IUI结局的影响，在DFI≤20%中，Isolate密度梯度离心法和上游法的临床妊娠率两组间差异无统计学意义（P>0.05）；但在DFI>20%中，Isolate密度梯度离心法的临床妊娠率比上游法高，差异有统计学意义（P<0.05）。IUI后的临床妊娠率变化趋势与处理后的精子DFI一致。曹晓敏等[10]发现IUI中非妊娠组的精子DFI显著高于妊娠组，表明精子DFI与IUI的临床妊娠率有关。本研究结果也表明高精子DFI的精液经优化处理后，IUI后的临床妊娠率与精子DFI的改变有关。

综上所述，Isolate密度梯度离心法和上游法均可优选出活力高和DNA损伤少的精子，上游法在提高精子活力方面比Isolate密度梯度离心法更有效，Isolate密度梯度离心法则对精子DNA碎片化程度高的精液精子降低DFI值比上游法更有效，且可显著提高IUI的临床妊娠率。因此，在进行辅助生殖治疗前建议男性患者先行精子DFI的检测，对精子DFI较高者推荐使用Isolate密度梯度离心法进行精液优化处理，以期得到良好的受精结局。