羊睾丸原代细胞传代试验

张玉红，何玉仙，井莲娜，王玉红

（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐830011）

羊睾丸原代细胞传代试验

张玉红，何玉仙，井莲娜，王玉红

（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐830011）

生产山羊痘活疫苗时，羊睾丸采集工作量大，易污染，费时费事，是否有办法减少人员外出采集羊睾丸次数，值得摸索，本实验将长成单层的羊睾丸细胞进行传代，长成致密单层后进行接毒，收获毒液，并对毒液及疫苗成品进行病毒含量测定，结果表明，羊睾丸细胞完全可以传一代，细胞形态良好，毒液、疫苗成品毒价均达到规程要求，羊睾丸原代细胞传代可以大大提高睾丸组织利用率，降低人员劳动强度。

羊痘疫苗；原代细胞；传代

羊痘(Capripox)又名羊“天花”,是由山羊痘病毒属(Capripoxvirus,CPV)的痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,主要表现为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病[1]。此外，还有人类感染羊痘的报道，世界各国都重视本病[2]。皮肤是病毒复制的主要场所[3]。本病只有羊感染发病，根据临床症状，结合其流行病学特征，就可以做出初步诊断。实验室诊断方法有多种，如病毒培养分离法、病毒中和试验(VN)、琼脂扩散试验(AGID)、对流免疫电泳(CIEP)乳胶凝集试验、ELISA实验、Western印迹实验、荧光抗体实验和间接荧光抗体试验等[4]。

1 材料与方法

1.1 羊睾丸细胞传代试验

1.1.1 羊睾丸组织

乌鲁木齐市郊区个体养殖户处采集4月龄以内的健康雄性绵羊羔羊睾丸。

1.1.2 健康细胞

由本公司羊痘生产组提供生长良好的健康的羊睾丸原代细胞。

1.1.3 种毒

山羊痘睾丸细胞培养弱毒株STV42，1983年9月16日冻干，各项指标符合兽用生物制品制造规程[5]要求，由中国兽药监察所提供，由本厂羊痘生产组连续传代2次进行种毒适应和复壮，随后直接通过转瓶培养，按照含1%～2%的毒种的细胞维持液生产的毒液用作种毒，冻干保存。按规程检验各项指标符合规程中种毒要求。

1.1.4 仪器与设备

冰箱（海尔公司BCD216TDZA）、倒置显微镜（PULL公司生产的BDS-300）、计数板、水浴箱、15 000 mL血清瓶等均为国产。

1.1.5 方法

将生长良好的健康绵羊羔睾丸原代细胞，倒去生长液，加入原生长液量1/10的预热的0.25%胰酶进行消化，待细胞层呈雪花状时，倒去胰酶，先用少许生长液摇下细胞，然后按1∶2的分种率，补足生长液，混匀、分装，37℃旋转培养，观察细胞形态，待细胞长成单层后，接入含有1%～2%种毒的乳汉液，观察细胞病变（CPE）达75%时冻结，再融化刮一次，共冻融两次，每次一个大转消化后分瓶的两个大转收的毒液混为一组，分别依上述方式重复6次试验。

1.2 羊睾丸原代细胞制备试验

按兽用生物制品制造规程要求选用四月龄以内的健康雄性绵羊，无菌摘取睾丸，剥弃白膜鞘膜，称取12 g睾丸组织，剪碎、漂洗、消化、分散，收集乳汉液定量1 500 mL细胞液分装于一个大转，细胞充分摇匀，于37℃温室旋转培养。，观察细胞形态。待细胞长成单层后，接入含有1%～2%种毒的乳汉液，观察细胞病变（CPE）达75%时冻结，再融化刮一次，共冻融两次，每次一个大转为一组，分别依上述方式重复6次试验。

1.3 毒液半成品、成品的病毒含量（TCID50）的测定

将上述2组病毒液的样品进行无检并用细胞测毒法检测病毒含量（TCID50/mL）。将上述2组病毒液制成的成品样进行无检并测定疫苗中的病毒含量（TCID50/头份）。

2 结果

2.1 原代细胞传代一代后试验结果

原代细胞与传代细胞实验结果比较,可以看出原代细胞经胰酶消化传代一代的细胞长成单层所用的时间在四天左右,与原代细胞长成单层的时间差别不明显，结果见表1。

表1 传代一代的细胞与原代细胞长成单层所用的时间对比情况

2.2 传代一代的病毒液半成品的病毒含量测定

原代细胞与传代细胞实验结果比较,传代细胞获得的病毒液半成品病毒含量TCID50=106.1,符合规程要求的半成品TCID50》5.5要求,与原代细胞半成品毒价检测结果差别不明显,结果见表2。

表2 传代细胞与原代细胞半成品及成品病毒含量测定对比情况

2.3 传一代获得的成品疫苗的效力检验

效力检验用羊检验，将成品疫苗用生理盐水稀释成0.5 mL含0.01个使用剂量，胸腹部皮内注射山羊3只，每只2颗，每颗0.5 mL，观察15 d。在接种后5～7 d应至少有2只山羊出现直径为0.5～3 cm微紫红色或无色痘肿反应，且持续4 d以上，逐渐消退。发痘羊间或可有轻度体温反应，但精神食欲正常。试验发痘情况见表3。其它体征均正常,结果表明原代细胞与传代细胞效检均达到规程要求。

表3 传代细胞与原代细胞成品效力检验对比情况

3 讨论

从羊睾丸原代细胞传代一代结果可以看出，传代一代细胞形态正常，细胞传代一代的半成品、成品毒价均达到规程要求，说明羊睾丸原代细胞进行传代完全是可行的。目前仅传了一代。

由表4可以看出，同样制备3 000 mL毒液，原代细胞与传代细胞长成单层的时间差别不大，因此传代与不传代的生产周期基本一样，进行传代可以减少一倍人员外出采集睾丸的次数，大大降低人员劳动强度，进行传代可以减少一半的睾丸用量，提高了睾丸组织的利用率，从表4可见，原代细胞的成本低于传代细胞，但原代细胞人员比传代细胞要多一倍，加上人员的费用二者成本差异不显著。选择何种方式进行生产完全在于生产者本身的出发点。

表4 原代细胞与传代细胞经济效益对比

本实验仅仅将羊睾丸原代细胞传了一代，是否能继续往下传，能传几代，传代后的细胞形态如何，而且传代后的半成品、成品毒价如何，都有待于进一步去跟进。

羊睾丸原代细胞传代一代的成功也为其它原代细胞如猪瘟细胞苗的传代奠定了技术基础。

[1]CRAN V M.Control of capripoxvirus infection[J].Vaccine,1993,11(3):1275-1279.

[2]洪艳，谢忠文，施恒豫.人感染山羊痘5例[J].中华传染病杂志,2005,23(2):143.

[3]BOWDEN TR BABIUK S L PARKYN G R et a.l Capripoxvirus tissue tropism and shedding:A quantitative study in experimentally infected sheep and goats[J].Virology,2008,371(2):380-393.

[4]徐维加，等.羊痘诊断与预防的研究进展[J].畜牧兽医科技2007，（3）：4-5.

[5]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽医生物制品规程(2000年)[M].北京:化学工业出版社, 2000:142.

Subculture of Sheep Testicular Primary Cells

ZHANG Yu-hong，HE Yu-xian,JIN Lian-na,WANG Yu-hong
（Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830011，China）

when we produce goat pox vaccine,sheep testicles acquisition is a heavy job which was easily contaminated,time-consuming and cumbersome.Whether there are some ways to reduce our staff go out to collect sheep testicles,is worth fumble.In this experiment,a monolayer of sheep testicular cells were passaged so as to grow into a dense monolayer after inoculation,and to harvest venom,and measured the dose of virus. The results show that sheep testicular cells completely could subculture to one generation,and the cell morphology is satisfied to do next experiment,the venom and the final vaccine titer reached our requirements. Culture of generated cells can greatly improve working efficiency,and could reduce labor intensity.

goat pox vaccine;primary cells

S852.5

A

1003－6377（2013）03－0057-03

2013-02-11

张玉红（1971-），女，兽医师，主要从事疫苗生产工作。