饲料沸石抗菌剂体外抑菌活性的测定

单展展 王秀丽 张小虎 等

摘要：以广西产天然红辉沸石为原料制备Ａ型分子筛，采用离子交换法制备二甲酸钾沸石抗菌剂。用Ｘ射线衍射仪（ＸＲＤ）和扫描电镜对其进行表征分析，结果表明，Ａ型沸石分子筛成功接枝吸附了二甲酸钾。采用菌落计数法对Ａ型沸石抗菌剂的抑菌性能进行检测，表明最佳大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌落计数吸光度值的范围为０．５００～０．７００，沸石抗菌剂对大肠杆菌的抑菌率达８９．５％。

关键词：沸石抗菌剂；菌落计数法；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）

中图分类号：Ｓ４８２．２＋１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）15－3240-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｆｅｅｄ Ｚｅｏｌｉｔｅ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｇｅｎｔ

ＳＨＡＮ Ｚｈａｎ－ｚｈａｎａ，ＷＡＮＧ Ｘｉｕ－ｌｉａ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｈｕｂ，ＣＨＥＮ Ｎａｎ－ｃｈｕｎｂ，ｃ，ＹＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｋｕｎａ，ＬＩＵ Ｆａｎｇｂ

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Cｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Bｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｃ． Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｏｎｆｅｒｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４， Ｇｕａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Nａｔｕｒａｌ ｓｔｅｌｌｅｒｉｔｅ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ was used ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｙｐｅ－Ａ ｚｅｏｌｉｔｅ； and ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ was applied ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｆｏｒｍａｔｅ－ｌｏａｄｅｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ which ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ＸＲＤ ａｎｄ ＳＥＭ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ the ｔｙｐｅ－Ａ ｚｅｏｌｉｔｅ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｇｒａｆｔ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｆｏｒｍａｔｅ．Ｔａｋｉｎｇ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｔｙｐｅ－Ａ ｚｅｏｌｉｔｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， tｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔ ｗａｓ ０．５００～０．７００． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ ｏｎ Ｅ． ｃｏｌｉｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ｔｏ ８９．５％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｚｅｏｌｉｔｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ； ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ

抗菌剂大体可分为有机抗菌剂和无机抗菌剂，与有机抗菌剂相比，无机抗菌剂具有高效、广谱、持久、可加工性好、安全稳定的特点［１，２］。沸石抗菌剂是目前最常用的无机抗菌剂之一，是通过物理吸附或离子交换等方法将抗菌剂交换到沸石上制备而成［３－７］。二甲酸钾是一种有机酸盐，具有无抗药性、无残留、无毒害等特点。其在酸性条件下稳定，而在中性或偏碱性的条件下则分解为甲酸与甲酸钾。二甲酸钾添加至饲料中能有效降低动物消化道ｐＨ，抑制肠道微生物生长，从而促进畜禽生长性能和胴体的品质［８］。但二甲酸钾在胃中吸收较快，大都无法到达小肠，不能有效降低小肠中的酸度，无法抑制有害菌生长、促进有益菌生长。国内外对抗菌剂的研究主要集中在载银沸石抗菌剂上［９，１０］，然而重金属离子易在生物体内沉积而无法应用于饲料。本研究以Ａ型沸石分子筛为载体制备了载二甲酸钾的沸石抗菌剂，对其进行表征，并对其抑菌性能进行了测定。

１材料与方法

１．１Ａ型沸石分子筛及沸石抗菌剂的制备与表征

红辉沸石粉末按液固比３∶１加入１５％ＨＣｌ溶液中，９０ ℃、２ ｈ电动搅拌，过滤，洗涤至无Ｃｌ－，烘干成酸化沸石。按照质量比酸化沸石∶ＮａＯＨ∶ＮａＡｌＯ２∶Ｈ２Ｏ＝１∶２∶１∶４８，先将ＮａＯＨ和ＮａＡｌＯ２配制成溶液，然后依次加入到三颈瓶中，在晶化温度９０ ℃和晶化时间６ ｈ下磁力搅拌，产物经过滤、洗涤、烘干后得到Ａ型沸石分子筛。取２ ｇ Ａ型沸石分子筛加入到一定浓度的二甲酸钾溶液２０ ｍＬ中，在一定的反应时间、温度、ｐＨ下进行吸附，产物洗涤后在６０ ℃下烘干待用。

采用荷兰帕纳科公司（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ）生产的Ｘｐｅｒｔ Ｐｒｏ型粉末X射线衍射仪（ＸＲＤ）对沸石原矿和Ａ型沸石分子筛进行表征，X射线发生器的最大管电压：６０ ｋＶ，最大电流：５５ ｍＡ，２．２ｋＷ（Ｃｕ靶Ｋａ辐射，λ＝１．５４０ ６０ ｎｍ）；采用日本电子（ＪＥＯＬ）公司生产的扫描电子显微镜（ＳＥＭ）对Ａ型分子筛和Ａ型沸石抗菌剂进行表征，二次电子分辨率：３．０ ｎｍ（３０ ｋＶ，高真空模式）；放大倍数：１０～３００ ０００。

１．２Ａ型沸石抗菌剂抑菌活性测定

取大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）营养琼脂培养基斜面培养１８～２４ ｈ的新鲜培养物，接种一环于上述营养液体培养基（不加琼脂）中培养１６ ｈ，于６００ ｎｍ下测定吸光度［１１］，取１ ｍＬ菌液，用０．１％磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，０．０３ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ ７．２～７．４）稀释至１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５ 、１０－６，然后涂布计数菌落数量确定适宜浓度。 以空白培养基作对照，涂布菌落计数。用ＰＢＳ缓冲液稀释菌悬液至１０６ ＣFU／ｍＬ。分别称取沸石原矿和沸石抗菌剂粉末０．５００ ｇ放入三角烧瓶中，加入９５ ｍＬ ＰＢＳ缓冲液和５ ｍＬ预制菌悬液。固定于恒温振荡培养箱的摇床上，在３７ ℃条件下，以１５０ ｒ／ｍｉｎ速度振荡接触４ ｈ，后将振荡后的样液和对照样液稀释到１０－５、１０－６，吸取５００ μＬ于灭菌空白平皿中，每样液平行接种两个平皿，倾注４５～５５ ℃的琼脂培养基，待凝固后接种不同浓度大肠杆菌菌悬液置于３７ ℃恒温培养箱中，４８ ｈ后做菌落计数， 对照样液记作Ａ０，振荡试样记作Ａ４８。

２结果与分析

２．１沸石与分子筛ＸＲＤ对比分析

图１和图２分别为沸石原矿和Ａ型沸石分子筛的衍射图，对比两图可看出两者衍射峰值有很大的差异，表明后者结构已发生变化，形成了新的产物，产物中Ａ型沸石强度极大，晶形完好，结晶度大。由于红辉沸石中含有玉髓状石英，在强酸作用下不会发生溶解，故产物中含有少量的石英杂晶。

２．２分子筛与抗菌剂ＳＥＭ对比分析

图３和图４分别为Ａ型沸石分子筛和Ａ型沸石抗菌剂的ＳＥＭ图，前者晶粒呈立方体状，晶形比较完整，粒度比较均匀。而后者晶粒模糊，表面有蓬松的葡萄状颗粒，充分表明二甲酸钾已吸附或者接枝在Ａ型沸石分子筛上。

２．３抑菌特征

对Ａ型沸石分子筛进行梯度稀释，用涂布平板菌落计数的方法观察各浓度梯度的菌落数，绘制出菌落数随吸光度值变化的曲线如图５。由图５可看出，菌落数随着吸光度值的增加而呈逐次递增的线性变化，且最佳大肠杆菌菌落计数吸光度值的范围为０．５００～０．７００。

取吸光度值为０．５００～０．７００的大肠杆菌菌液进行试验，计算出振荡后抗菌剂与红辉沸石粉末对大肠杆菌的抑菌率如表１。由表１可以看出，振荡后对照抑菌率达８．６％，小于１０．０％，表明对照样本无明显的抑菌作用。振荡后Ａ型沸石抗菌剂的抑菌率达８９．５％，远大于８．７％，表明Ａ型沸石抗菌剂的抑菌作用非常明显，添加至饲料中可有效抑制动物体内的大肠杆菌的生长。

３结论

本实验主要研究了Ａ型沸石抗菌剂对大肠杆菌生长的抑制作用。探究普通营养琼脂培养基中大肠杆菌的最佳生长浓度梯度，并用广西红辉沸石粉末作对照，采用平板计数与菌液混合培养法，考察对大肠杆菌生长的抑制作用，结论如下：

１）通过ＸＲＤ和ＳＥＭ的对比分析可知，Ａ型沸石分子筛已成功吸附二甲酸钾。

２）最佳大肠杆菌菌落计数吸光度值的范围为０．５００～０．７００，较适合的浓度梯度为１０－５与１０－６，各生长菌落数的数量级为１０６ ＣFU／ｍＬ。

３）Ａ型沸石抗菌剂与广西红辉沸石粉末对大肠杆菌的生长均有不同程度的抑制效果，Ａ型沸石抗菌剂的效果更加明显。振荡后Ａ型沸石抗菌剂的抑菌率达８９．５％，从而有效抑制肠道有害菌，维持和改善肠道微生态平衡。沸石原矿也有一定的抑菌作用，这是因为其内部结构中含有银元素的缘故。

参考文献：

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