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适应度代价对大肠杆菌药物敏感性恢复的作用

2016-04-20孙硕吕世明谭艾娟华夏李博岩焦亚

天津农业科学 2016年4期
关键词:大肠杆菌

孙硕 吕世明 谭艾娟 华夏 李博岩 焦亚琴

摘 要:通过测定野生型大肠杆菌对氟喹诺酮类药物敏感的、耐药的以及从耐药诱导恢复敏感的3种菌株的生长曲线,探讨适应度代价对细菌耐药性变化的影响。结果表明:对氟喹诺酮类药物耐药的大肠杆菌C02的生长速率远低于敏感菌株C01和恢复敏感性后菌株C03; 而敏感菌株C01和敏感性恢复菌株C03的细菌生长曲线相近,说明在无药物选择压力环境中,适应度代价高的耐药菌生存竞争力低于适应度代价低的敏感菌,敏感菌逐渐取代耐药菌,使菌群对药物的敏感性得以恢复。

关键词:大肠杆菌;氟喹诺酮类药物;适合度代价;生长曲线;敏感性恢复

中图分类号:R378.2+1 文献标识码:A DOI 编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.008

Abstract: To discuss the effect of the fitness cost on drug-resistanc reversal of Escherichia coli, the growth curves of three strains E.coli, which E. coli C01 was sensitivity to fluoroquinolones, E. coli C02 was resistance to fluoroquinolones and E. coli C03 was restored sensitivity to fluoroquinolones, were determined. The result showed that the growth velocity of E. coli C02 resistented to fluoroquinolones was far lower than E. coli C01 or E. coli C03, and the growth velocities of E. coli C01 or E. coli C03 were quit similar. It demonstated that the survival competitiveness of drug-resistant bacteria possessed the high fitness cost was lower than sensitive one armied low fitness cost in the environment of no drug selection pressure. The drug-resistant bacteria was gradually replaced by ensitive bacteria and the drug sensitivity of microbiome was restored.

Key words: Escherichia coli; fluoroquinolones; fitness cost; growth curve; sestore sensitivity

细菌耐药性是现代医学所面临的一大重要难题,近几年的统计发现细菌的耐药率呈现普遍上升趋势[1-2]。在养殖业中抗菌药物的不规范用药,导致动物源细菌耐药水平不断升高,对养殖业健康发展构成严重威胁,并增加了动物性食品的不安全性[3],因此,探索降低或消除细菌耐药性已经成为当前研究的热点。研究表明,高度耐药的沙门氏菌在没有药物选择压力的环境中其适合度代价将升高[4],其生长竞争力低于敏感菌,使得敏感菌成为优势菌群,最终取代耐药菌而恢复对药物的敏感性。故养殖场可通过停止使用某种抗菌药物来恢复细菌对该药物的敏感性[5]。本研究通过测定对耐氟喹诺酮类药物不同耐药状态大肠杆菌的生长曲线,考察对氟喹诺酮类药物耐药大肠杆菌生存适合度代价在细菌耐药性恢复上的作用,为养殖场制定合理的轮换用药方案,降低细菌耐药性的危害提供支持。

1 材料和方法

1.1 菌株、药物和试剂

药物:环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星,均购自大连美仑生物技术有限公司。试剂:LB培养基、伊红美兰琼脂、MHB琼脂均购于上海博微生物科技有限公司。

菌株:大肠杆菌质控菌株ATCC 25922,购自中国兽药监察所;野生型猪源大肠杆菌由贵州大学动物科学学院药理实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 大肠杆菌对五种氟喹诺酮类药物MIC的测定 参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)抗菌药物敏感性实验操作标准,采用微量肉汤稀释法,测定猪源大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星5种氟喹诺酮类药物的MIC。

1.2.2 耐药大肠杆菌C02诱导 通过药敏试验筛选得到野生型敏感大肠杆菌C01,将C01在含有1/2MIC喹诺酮类药物的LB肉汤培养基中传代培养诱导,使其对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星均表现为中度耐药(C02)。

1.2.3 耐药菌敏感性恢复诱导 将耐药菌C02与敏感菌C01按95%:5%的比例混合后取1 mL加到4 mL的LB肉汤中,置于37 °C,传代230代,测定MIC值。

1.2.4 细菌生长曲线测定 参照任慧英方法改进,在600 nm的光密度下测量LB肉汤培养基中大肠杆菌的生长曲线。将敏感的C01菌株和诱导耐药的C02、C03菌株分别置于LB肉汤培养基中,37 °C下分别培养0,0.5,1,1.5,2,2.5,3, 3.5,4,5,6,7,8,9,12 h,然后分别测定它们的OD值,并绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 药敏试验结果

通过表1可以看出,野生型敏感大肠杆菌C01对5种氟喹诺酮类药物均敏感,而C01经短时间药物诱导后得到的大肠杆菌C02对5种药物呈现中度耐药,耐药的C02在无药环境和有敏感菌存在条件下连续传代培养得到CO3,其对5种药物的MIC值恢复至敏感性。

2.2 细菌生长曲线测定

从C01、C02、C03的生长曲线(图1)可以看出,对药物敏感的C01和C03生长趋势和速率十分相近,而对药物耐药的C02的增长率远远低于C01和C03,证明大肠杆菌的耐药性可提高细菌的适合度代价,可降低细菌的生长率。

3 讨 论

细菌的适合度代价是指在没有选择压力条件下,如果特定基因型个体的适合度低于种群平均的适合度,即可以认为该基因型存在适合度代价。在药物选择压力下,个别细菌可通过有意义的基因突变或接受其他耐药菌的耐药基因而获得对药物的耐药性,提高了其在有药物环境中的生存适应度,成为优势菌,并逐渐取代敏感菌而表现对药物耐药 [6-8]。但在没有药物选择压力的环境中,耐药菌由于生存适合度代价的升高,其适应性、毒力及质粒转移率均较敏感株明显下降,敏感株处于主导优势,能抑制耐药菌的生长,甚至在一定时间内将耐药菌清除,使细菌群体对药物的敏感性得以恢复[9]。

研究结果表明,耐药菌在无药环境中的生长速率大大低于敏感菌,说明获得高度耐药细菌在没有抗菌药物的选择压力时生存适合度高于敏感菌;将敏感菌参入耐药菌中后置于无药环境中传代230代,可使细菌对药物的敏感性得以恢复,试验结果证实了细菌生存适应度代价的高低对细菌种群进化方向的影响,同时,在实验室条件下证实了养殖生产中和临床治疗中可采用轮换用药来对抗细菌耐药性危害的机制。

因此,规范用药、建立合理的轮换用药机制,对养殖业中细菌耐药率和耐药水平的控制有很大意义。

参考文献:

[1] 胡付品,朱德妹,汪复,等.2013年中国CHINET细菌耐药性检测[J].中国感染与化疗杂志,2014,14(5):365-374.

[2] 胡付品,朱德妹,汪复,等.2014年中国CHINET细菌耐药性检测[J].中国感染与化疗杂志,2015,15(5):401-410.

[3] 汪雪雁,祁克宗,朱良强.三种氟喹诺酮类药物在鸡体内的组织残留[J]. 食品科学,2007,11:468-472.

[4] CHOI J, SHIN D, RYU S. Implication of quorum sensing in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence: the luxS gene is necessary for expression of genes in pathogenicity island 1. Infect[J]. Immun, 2007,75:4885-4890.

[5] O'REGAN E, QUINN T, FRYE J G, et al. Fitness costs and stability of a high-level ciprofloxacin resistance phenotype in Salmonella enterica serotype enteritidis:reduced infectivity associated with decreased expression of Salmonella pathogenicity island 1 genes[J]. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,2010(1):367-374.

[6] 张石革.我国细菌耐药性的趋势与临床对策[J]. 中国医院用药评价与分析,2014,14(8):680-682.

[7] ALONSO A, MORALES G, ESCALANTE R,et al. Martinez. Overexpression of the multidrug efflux pump SmeDEF impairs Stenotrophomonas maltophilia physiology[J]. Antimicrob Chemother, 2004,53:432-434.

[8] SILVA R F, MENDONCA C M, CARVALHO L M,et a1.Pervasive sign epistasis between conjugative plasmids and drug-resistance chromosomal mutations [J].PLoS Genet,2011,7(7):1002181.

[9] MAHER M C, ALEMAYEHU W, LAKEW T, et al. The fitness cost of antibiotic resistance in streptococcus pneumoniae: insight from the field [J]. PLOS ONE, 2012,7(1):1-5.

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