吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏TIMP-1、TGF-β1和PDGF-β表达的影响

熊盛池 谢 燕▲ 熊 利

1.四川省凉山彝族自治州第一人民医院内分泌科，四川西昌 615000；2.四川省喜德县两河口中心卫生院内科，四川喜德 615000

吡格列酮为噻唑烷二酮类降糖药，其作用机制是高选择性地激动过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），PPAR-γ的活化可调节许多控制葡萄糖及脂类代谢的胰岛素相关基因的转录，具有降糖、抗炎、改善脂质代谢、抑制细胞生长因子、降低尿蛋白排泄、增加胰岛素敏感性等重要作用。本研究以吡格列酮干预糖尿病（diabetic mellitus，DM）大鼠肾脏基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP1）、转化生长因子（TGF-β1）和血小板衍生生长因子β（PDGF-β）的表达，以观察其对糖尿病大鼠肾脏保护的作用机制，为临床对糖尿病肾病的治疗提出良好的参考资料。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 动物 6～8周龄、体重180～200 g的健康雄性SD清洁级大鼠70只，全部购自重庆医科大学动物实验中心，许可证号SYXK（渝）2004008。

1.1.2 试剂 厄贝沙坦（杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司，J20030113）；吡格列酮（北京太阳药业有限公司，H20040267） ；PDGF-β兔多克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；TIMP-1试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司；TGF-β1试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备 按参考文献[1]稍加修改建立模型。取SD大鼠60只禁食12 h后，按60 mg/kg左下腹腔注射链脲佐菌素（STZ），制造DM大鼠模型。实验期间给予足够的饮水，造模4 h后腹腔注射20%的葡萄糖3～5 mL，避免低血糖死亡，72 h后大鼠尾尖取血测空腹血糖，血糖≥16.0 mmol/L确定为DM成模大鼠。将成模大鼠随机抽样分成4组：吡格列酮组、模型组、吡格列酮+厄贝沙坦组、厄贝沙坦组各14只。同时取10只正常大鼠作为正常对照，腹腔注射等剂量无菌柠檬酸钠缓冲液，后在尾尖取血测血糖，血糖均在4.0～8.0 mmol/L。上述方法造模7 d后，吡格列酮组按15 mg/（kg·d）配以3～5 mL蒸馏水灌胃；厄贝沙坦组按50 mg/（kg·d）配以同等量蒸馏水灌胃；吡格列酮+厄贝沙坦组分别给予吡格列酮 15 mg/（kg·d）和厄贝沙坦50 mg/（kg·d）配以同等量蒸馏水灌胃，每日早晨8点～9点灌胃1次，模型组和正常对照组大鼠每日同一时间给予等量蒸馏水灌胃。对血糖≥20.0 mmol/L可能危及生存的大鼠皮下注射诺和灵N 2～3 U以防糖尿病酮症酸中毒死亡。大鼠自由饮水、进食，室温18～20℃，湿度60% ～70%，上述方法喂养12 周。

1.2.2 取材与固定 所有大鼠在喂养12周后空腹称重量，以3%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血以备行肾功能等生化检查，后剖腹分离双侧肾脏，每侧肾脏各取1/2肾组织放入4%多聚甲醛液固定保存24 h后脱水，石蜡包埋，切片，每片厚5 μm，行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和免疫组织化学检测。其余肾脏标本用液氮冷冻保存，准备免疫蛋白印迹（Western blotting）等检测。

1.3 主要观察指标

（1）一般情况观察；（2）肾脏病理检查：处死大鼠时，肉眼观察肾脏外观情况，肾组织行HE染色；（3）肾组织TIMP-1，TGF-β1免疫组化染色（三步法）；（4）Western blotting检测糖尿病大鼠肾组织PDGF-β蛋白。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况观察

DM大鼠均出现多尿、烦渴、多饮、体重减轻等糖尿病表现，部分大鼠有视力下降、皮肤溃烂和感染并发症。模型组症状及并发症最明显，实验期间有4只死亡；正常组无死亡大鼠，其余各组症状轻微，实验期间仅有2 只死亡，厄贝沙坦组和吡格列酮组各死亡1只。

2.2 各组大鼠肾脏组织病理学的特点

HE染色见模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜区有基底膜基质沉积，出现毛细血管袢折叠和融合，毛细血管阻塞。吡格列酮组、厄贝沙坦组和吡格列酮+厄贝沙坦组仅有毛细管基底膜增厚，系膜区有基底膜基质沉积，且明显轻于模型组。正常对照组大鼠肾组织结构无明显异常。见图1。

2.3 各组大鼠TIMP-1的表达

TIMP-1阳性染色主要位于肾小球毛细血管基底膜、系膜区、肾小管基底膜及毛细血管袢处。正常对照组大鼠肾小球毛细血管基底膜、系膜区、肾小管基底膜上皮细胞及毛细血管袢处仅有微弱表达，见图2。定量分析显示，模型组TIMP-1上述部位表达显著多于正常对照组，吡格列酮组、厄贝沙坦组和吡格列酮+厄贝沙坦组TIMP-1表达显著少于模型组，吡格列酮组+厄贝沙坦组表达减少较吡格列酮组和厄贝沙坦组更为明显，差异均有统计学意义（P＜0.05），不过上述部位表达均多于正常对照组；吡格列酮组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义（P＞0.05） 。

图1 A-E 各组大鼠肾脏HE染色（×200）

图2 A-E 各组大鼠肾脏免疫组化TIMP-1的表达（×200）

2.4 各组大鼠TGF-β1表达

糖尿病大鼠与正常对照组大鼠比较，前者肾小球脏层上皮细胞、毛细血管基底膜及系膜区肾小球上皮细胞、肾小管基底膜及及毛细血管袢TGF-β1均有明显表达，后者TGF-β1主要在肾小球脏层上皮细胞、毛细血管基底膜及系膜区有微弱表达。见图3。定量分析显示，模型组TGF-β1表达显著多于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；厄贝沙坦组、吡格列酮组和吡格列酮+厄贝沙坦组TGF-β1表达显著少于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；吡格列酮+厄贝沙坦组TGF-β1表达显著少于吡格列酮组和厄贝沙坦，差异有统计学意义（P＜0.05），不过上述部位表达仍然多于正常对照组；厄贝沙坦组与吡格列酮组TGF-β1表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1 。

图3 A-E 各组大鼠肾脏免疫组化TGF-β1的表达（×200）

表1 12周后各组大鼠肾脏组织TIMP-1和TGF-β1的表达（±s）

表1 12周后各组大鼠肾脏组织TIMP-1和TGF-β1的表达（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与厄贝沙坦组比较，#P＜0.01；与吡格列酮+厄贝沙坦组比较，&P＜0.05

组别 n TIMP-1 TGF-β1正常对照组 10 0.072±0.016 0.057±0.016模型组 11 0.201±0.013* 0.195±0.016*吡格列酮组 12 0.148±0.014*△& 0.131±0.020*△&厄贝沙坦组 12 0.142±0.022*△ 0.129±0.021*△吡格列酮+厄贝沙坦组 12 0.112±0.015*△# 0.102±0.015 *△#

2.5 各组大鼠PDGF-β表达

Western blotting检测技术显示，模型组大鼠肾组织PDGF-β表达显著多于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组肾组织PDGF-β仅有微弱表达，厄贝沙坦组、吡格列酮组、吡格列酮+厄贝沙坦组PDGF-β表达显著少于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；吡格列酮+厄贝沙坦组PDGF-β表达少于厄贝沙坦组、吡格列酮组，而多于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；吡格列酮组与厄贝沙坦组PDGF-β表达比较，差异无明显统计学意义（P＞0.05）。见图4、表2。

图4 各组大鼠肾脏Western blotting PDGF-β的表达（依次为厄贝沙坦组，糖尿病模型组，吡格列酮组+厄贝沙坦组，吡格列酮组，正常对照组）

表2 12周后各组大鼠肾脏组织PDGF-β的表达（±s）

表2 12周后各组大鼠肾脏组织PDGF-β的表达（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与厄贝沙坦组比较，#P＜0.01；与吡格列酮组比较，&P＜0.05

组别 n 肾PDGF-β正常对照组 10 63 542±1 245模型组 10 136 453±1 756*吡格列酮组 10 96 428±1 603*△厄贝沙坦组 10 97 439±1 667*△吡格列酮+厄贝沙坦组 10 84 539±1 167*△&#

3 讨论

TGF-β1是促纤维化最重要的因子之一，通过刺激细胞外基质的产生[2]，抑制蛋白酶和胶原酶，减少基质的降解，使细胞外基质在肾脏大量沉积，进一步发展为肾组织纤维化。肾纤维化是细胞外基质过度沉积所致，但胶原的降解减少也是重要原因。细胞外基质由基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制因子TIMPs调节，前者的作用是降解胶原，而后者的作用恰恰是对抗MMPs，导致胶原的降解减少。所以增加MMPs或减少TIMP-1在肾组织的表达，均可使细胞外基质减少。因此TIMP-1对肾纤维化的形成有不容忽视的重要地位[3]。PDGF是一种潜在的促有丝分裂的细胞因子，主要分布于增生的毛细血管内皮细胞、成纤维细胞和增生的肾小球细胞。一旦受到病理刺激，特别是糖尿病的长期刺激，PDGF就在上述部位过度表达，促进系膜细胞增生和细胞基质沉积，进而引起肾纤维化，最终糖尿病肾病一步一步形成，以致终末期肾病，肾衰竭。实验表明糖尿病大鼠肾小球PDGF-β和PDGF-β受体表达均增加[4]，PDGF-β链m RNA在糖尿病肾病小鼠肾组织中表达明显上调[5]。本研究中糖尿病大鼠肾组织PDGF-β表达增多，进一步肯定了这一研究。

近年来，随着罗格列酮争议不断，甚至于2010年9月23日已被FDA叫停，为了避免医患纠纷，大部分医务人员已经明显的减少了对该药的使用。吡格列酮为噻唑烷二酮类降糖药，药效肯定，价格低廉，在临床上广泛运用，不失为罗格列酮的绝佳替代品，最近的研究表明低剂量的吡格列酮长期治疗，可以显著改善糖尿病肾病患者的肾小球硬化和肾小管间质纤维化，延缓肾功能的恶化[6]，达到治疗的目的。而这些作用均与吡格列酮的抗氧化、抗炎、抑制细胞生长因子、降低尿蛋白排泄率作用密切相关。吡格列酮已经被证实可以降低甘油三酯、增加高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）而调节脂质代谢，从机制上有可能延缓动脉粥样硬化的形成[7]。大量研究表明吡格列酮可以减少TGF-β1在肾小球和肾小管的表达[8]。同时吡格列酮可以减少TIMP-l在糖尿病大鼠心肌组织的表达，通过抑制心肌纤维化的形成来实现[9]，就机制来说均是对组织纤维化的抑制，那么对肾组织纤维化的影响是不是一样的呢？本实验进一步肯定了这一论点。研究表明吡格列酮能减少或抑制PDGF-β在DM大鼠的肾小球和肾小管的表达，进而上调MMP-2的表达，抑制肾成纤维细胞IV型胶原的合成[10]，改善高糖状态下的肾小球和肾小管间质的纤维化，调节肾组织细胞外基质的合成和降解，延缓糖尿病肾损害的进展，发挥肾脏保护作用。

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