豚鼠耳蜗基底膜振动的测试方法

周　雷　许立富　塔　娜　饶柱石　黄新生△

(1复旦大学附属中山医院耳鼻咽喉科　上海　200032;2上海交通大学振动、冲击、噪声研究所机械系统与振动国家重点试验室　上海　200240)



豚鼠耳蜗基底膜振动的测试方法

周雷1许立富2塔娜2饶柱石2黄新生1△

(1复旦大学附属中山医院耳鼻咽喉科上海200032;2上海交通大学振动、冲击、噪声研究所机械系统与振动国家重点试验室上海200240)

【摘要】目的探索豚鼠耳蜗基底膜振动测试的方法。方法用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉豚鼠后,腹侧切口,逐层切开皮肤,分离肌肉,可见听泡位于豚鼠下颌骨内侧深面,钝性分离听泡表面的肌肉组织,暴露听泡,用电钻将听泡打开,可见螺旋形耳蜗结构,辨认基底膜所在的部位。用电钻在需要开孔的骨壁上轻磨一个环形的凹陷,待足够薄弱的时候用尖头的刀片挑开骨片。用具有微细尖端的不锈钢针蘸取少量反光微珠,放置在基底膜上。然后用激光多普勒测振仪(laser doppler vibrometer,LDV)测量基底膜在外耳道纯音激励下的振动。结果用该方法测量了豚鼠耳蜗基底膜在不同频率声波激励下的响应曲线。结论该方法可进行豚鼠耳蜗基底膜振动的离体实验,但活体的振动测试尚需进一步的探索。

【关键词】耳蜗;基底膜;激光多普勒测振仪;豚鼠;振动

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (8117091,11072145).

听觉是非常重要的感觉,对听觉机制的研究从未停止。19世纪60年代,Békésy在大量试验和观测的基础上提出了基底膜的行波理论,即不同频率的纯音输入可以在基底膜的不同部位产生最大的振幅。靠近卵圆窗处的基底膜对高频声音敏感,而蜗孔处的基底膜对低频声音敏感。然而,由于螺旋器的存在,使得基底膜具有更加复杂的主动机制参与声波信号的调制。1978年,Kemp[1]发现的耳声发射便是耳蜗基底膜主动特性的一个反应,作为客观测听在临床上已经广泛使用。

目前,人们对基底膜主动特性的了解还不够深入,对基底膜主动特性的探索具有重要意义[2]。哺乳动物具有相似的外、中、内耳结构,其中豚鼠的中、内耳结构与人极为相似,具有十分敏锐的听力,且个体小、易饲养,常被选做耳科实验动物[3]。除以上的优势外,豚鼠的耳蜗直接暴露在听泡中,耳蜗壁薄,有利于实验的进行[4]。因此,本实验选用豚鼠作为实验对象。

国外关于豚鼠耳蜗实验有较多的文献报导,主要研究耳蜗毛细胞的主动机制以及听觉神经传导通路[5-7]。国内郭梦和等[8-10]研究了各种理化因素对基底膜响应的影响。近年Chen等[11]用豚鼠进行了圆窗激励振子的实验研究,并用激光多普勒测振仪测量基底膜的振动来评价激励的效果。以上实验方法有相似之处,但均缺少对具体实验细节的描述,使得实验难以重复。本研究初期借鉴了这些实验方法,但是未能达到预期测试效果。本文试图寻找合适的麻醉状态下豚鼠耳蜗开孔及基底膜振动测试的方法。

材 料 和 方 法

动物和仪器选用英国种纯色豚鼠28只,雌雄不拘。动物的使用通过了复旦大学附属中山医院伦理审查委员会的伦理审查。实验器材包括:解剖显微镜 (Leica m651)、耳科电钻 (瑞士彼岸)、耳科显微解剖器械、小动物解剖台、电热毯、反光微珠 (Polytec Glass Beads)、激光多普勒测振仪(Polytec OFU 500)、信号发生器 (Tektronix AFG 3022B)、数据采集系统。麻醉药物包括新鲜配制的1.5%戊巴比妥钠和地西泮。

麻醉与气管切开本实验选用的28只豚鼠中,14只用于麻醉后行活体实验探索,体质量为 (582.32±138.24)g,另外14只豚鼠进行离体实验。在进行实验之前,豚鼠均通过健康检查,无中耳病变。

因豚鼠对麻醉比较敏感,麻醉死亡率高。本实验解剖及测试时间均较长,需要尽量延长豚鼠的麻醉维持时间,所以选择合适的麻醉方式十分关键。麻醉药物为新鲜配置的1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射,地西泮5 mg/kg肌肉注射。术中根据需要补充初始麻醉剂量的1/3。平均麻醉维持时间为 (3.14±1.67)h。由于豚鼠麻醉后容易出现呼吸困难,因而术中需要进行气管切开并置管。因未使用肌松剂,不需要进行辅助呼吸。

离体实验的14只豚鼠采用过量戊巴比妥钠腹腔注射进行过量麻醉,然后予以断头,将听泡解剖出后进行开孔及测试。

体位及解剖活体实验时豚鼠的体位对实验顺利进行有重要的影响。如能维持稳定的体位,将有利于实验的进行。本文采用颞骨夹将豚鼠固定于仰卧垂头位。

待麻醉起效后,剪去豚鼠手术侧下颌至颈部周围的毛发,并清除散落的毛屑。然后将豚鼠固定在小动物解剖台上,纵向切开豚鼠一侧下颌颈部的皮肤,长约3 cm (如图1所示的切口部位)。分离肌肉层,避开肌肉层下方的血管,避免不必要的出血。用显微撑开器将肌肉组织和下颌骨撑开,尽可能拓宽手术视野(图2)。分离并刮开听泡上的肌肉后便可看到白色、蛋壳样、呈球面的听泡[4]。向两边分开或去除听泡上的肌肉组织,以利于后续实验的进行。

耳蜗壁开孔豚鼠耳蜗骨壁坚硬而质脆,外力下容易破碎,所以不易打开一个合适大小的孔。实验初期曾采用国外文献中描述的方法,即用小的尖刀片缓慢将耳蜗壁削薄,然后再开孔[6,12-13]。但实际中操作十分困难,不适当的外力下容易使耳蜗破碎,改进实验方法以后便没有破碎发生。

RW:Round window;BM:Basilar membrane.

图1豚鼠体位示意图及打开听泡后的视野

Fig 1Illustration of guinea pig position and incision view after opening of the bulla

1:Basilar membrane; 2:Osseous spiral lamina; 3:Tympanic membrane; 4:Incus; 5:Incudostapedial joint;6:The basal turn of the cochlea.The right figure was the amplified view of the opening route on the cochlea.

图2显微镜下的豚鼠鼓室内结构

Fig 2Structures of tympanic cavity of guinea pig under microscope

经过多次摸索之后我们选用耳科电钻来开孔[7]。选用直径0.6 mm的金刚钻,低速模式 (转速低于7 000 /s),尽可能减少钻头振动对内耳的影响[14]。先用电钻在需要开孔的部位划出一个环形的区域 (图3),直径比开孔的孔径稍大,缓慢加深这条沟,直至沟的颜色变深,提示骨壁已经很薄。然后用刀刃长度5 mm、宽度1 mm的针式刀片的尖端轻轻插入这个环形磨薄区域的任一薄弱部分,稍用力挑起便可将骨片挑开,即完成开孔。如果刀片此时不能轻轻刺破这层已经被打薄的骨壁,则需要继续打磨,直至可以被刀片尖端轻易刺破。

放置反光微珠为减轻负重对基底膜的影响,测试所用的反光微珠为直径10～30 μm的玻璃球,肉眼下呈粉末状。用钝头的不锈钢针 (长度5 cm,针的末端直径0.12 mm)蘸取适量干燥的反光珠。微珠将被吸附在针的末端,但常会吸附过多的微珠。此时可在显微镜下将过多的微珠手动去除掉。然后将微珠小心放入耳蜗基底膜上。因为液体表面张力的作用,微珠很难被放入基底膜上,有时需要多次的尝试。此时显微镜的空间分辨率尤为重要,高分辨率的显微镜可以帮助辨识微珠及基底膜的位置(图4)。放置过程中会有少量淋巴液损失,活体标本会自行充盈,而离体标本则需要用生理盐水进行补充。

The left figure illustrated the bulla of guinea pig after opening of the cochlea boney wall.The right figure displayed theprofile of the cochlea by cutting along the line AB.ST: Scala tympani; SV:Scala vestibuli;CD: Cochlear duct;BM:Basilar membrane;VM:Vestibular membrane.

图3豚鼠耳蜗骨壁开孔示意图

Fig 3Diagram of the drilling process on the cochlea boney wall of guinea pig

基底膜振动测试如图5所示,本文采用信号发生器发生单频信号,驱动美国Etymotic公司的ER-2送声器,送声探管放置在外耳道中,外耳道口由送声管末端自带的海绵体封闭。ER-2送声器的频率范围是10～10 000 Hz,根据Ren等[13]的改造方法,可以将其频率范围提高到20 kHz,从而满足了本实验的要求。同时将测声系统ER-7C的测声探管放置在外耳道中距鼓膜2～3 mm处,用于监测离鼓膜脐部2 mm处的声压。将激光探头 (Polytec OFV 505)连接到单点激光多普勒测振仪上。在手术显微镜下通过微位移平台来微调标本的位置将激光探头的测试光点调整到基底膜的反光微珠上。把激光测振仪的输出端连接到LMS数据采集系统,通过数据采集即可获得基底膜的振动响应数据。

The right corner atlas in the circle was the amplified view under microscope.EAC:External auditory canal; LDV:Laser doppler vibrometer.

图5测试装置及测试过程示意图

Fig 5The diagram of instruments and measurement process

结果

通过送声器在外耳道处给予70 dB SPL的单频声激励,频率范围为1 000～19 000 Hz。由于测试难度较大,实验成功率不高,仅有7组数据符合测量要求,即信噪比达到10∶1。活体探索过程中均未能在活体时测得耳蜗基底膜的振动响应,因而数据均是离体样本所得。且数据结果基本是在改进实验方法之后获得。

基底膜振动位移对频率的函数见图6,相位见图7。可见基底膜的振动在5 kHz以下时比较平稳,之后缓慢上升,至11 kHz时达到最大值7.8 nm,之后迅速下降。相位呈两段式下降,在1～10 kHz时,缓慢下降,从11 kHz开始迅速下降,最高频率时达到了-1 400度左右。

讨论

豚鼠的固定和解剖实验中保持豚鼠在一固定的体位对实验的顺利进行十分重要。本文采用颞骨固定夹来固定豚鼠的头部,收到一定的效果,但是比较耗时。文献中使用的头部固定架[8]可能是一种良好的固定方式。

如果采用文献中描述的方法,即用特制的刀片将耳蜗骨壁逐渐刮薄之后再开孔,由于手术视野狭窄,活动空间有限,操作过程中较易损伤鼓膜及其他中耳结构。另外,所开的孔外形不规则 (图2),而且操作过程中难免会有骨粉掉落至基底膜上,如不及时清理将无法测量。但是清理时往往难以避免损伤基底膜。本文的方法可以在磨削过程中避免碎骨片落入耳蜗内,从而影响其响应机制。

为了避免过强的噪声和振动影响毛细胞功能,试验中采用了耳科电钻低速模式，并且通过逐渐打磨出一个环形孤岛的方式来开孔。试验中可以一次性将耳蜗骨壁打开,而快速、完好打开耳蜗骨壁避免了反复打磨耳蜗开孔的过程中损伤耳蜗基底膜。

反光微珠的放置既往文献对反光微珠的放置有较多的描述,既有用微量移液器放置[13],也有用注射器尖端蘸取微珠然后将其放置在耳蜗基底膜上[12]。本实验曾尝试用微量移液器来放置微珠。但是实验过程中很难保证一次吸入的微珠数量一致,因而难以保证放置在基底膜上的微珠数量一致。而且微量移液器的口径较大,对如此微小的微球放置依然是一个庞大的器具,难以保证精确。而注射器尖端的口径相对所开的耳蜗开孔来说过大,不适合微珠位置的调整。

另外,在放置反光微珠时鼓阶内淋巴液的表面张力会使得放置十分困难。因此可以考虑在耳蜗淋巴液被吸干且自发产生的淋巴液尚未来得及补充时放置微珠[15],有待进一步的试验验证。

活体测量探索在活体测量探索的过程中未能解决耳蜗开孔处出血的问题,仅有1例样本能达到活体耳蜗基底膜测量的要求,因而未能观测到耳蜗基底膜的主动特性。通过吸出鼓阶淋巴液并维持数分钟的方法来防止血液流向基底膜,待出血控制后再让耳蜗淋巴液自行补充[7],可能是一个较好的方法,也是进一步实验可尝试的手段。

采用本法可以快速、安全地进行耳蜗底旋骨壁开孔,并能避免反复磨削的骨粉落入耳蜗内,已成功测量了豚鼠基底膜的被动振动特性,因而可以作为一种较好的耳蜗基底膜振动测试的实验方法。探索了离体耳蜗的实验方法,但活体实验中未能解决耳蜗开孔处出血的问题,所以活体耳蜗振动试验是下一步研究的方向。

参考文献

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钦伦秀,男,博士,外科教授、主任医师、博士生导师。现任复旦大学附属华山医院院长助理兼外科主任、复旦大学肿瘤转移研究所所长。国家杰出青年基金获得者、长江学者特聘教授、教育部“肝癌转移复发机制与防治策略创新团队”带头人、国家重大科学研究计划(973)首席科学家,享受国务院特殊津贴。为国际肝癌学会(ILCA)创始会员、国家自然基金委医学部专家组成员,中国抗癌协会肿瘤转移专业委员会主任委员、上海医学会肿瘤靶分子专科委员会主任委员。为ClinExpMetastasis和ChinMedJ等14本杂志编委。

主要从事肝胆外科临床工作和肿瘤转移复发研究工作。每年手术治疗肝胆肿瘤患者约500例(包括半肝、三叶切除,肝尾状叶肿瘤,肝门脉胆管癌等各种高难度复杂手术),进行肝移植手术近百例。承担国家科技重大专项肝癌项目(课题组负责人)、国家重大科学研究计划(973)、863及国家自然科学基金国际合作重大项目等多项课题。发表SCI论文116篇, 发表的杂志包括Hepatology,Gut,CancerRes,Oncogene,ClinCancerRes,NewEnglJMed,Science,NatMed,Cancercell等。

主编专著《肿瘤的分子诊断与预测》(上海科技教育出版社,2004),为《现代肿瘤学》(第3版,复旦大学出版社,2011)和《肝癌转移复发的基础与临床》(上海科技教育出版社,2003)等2本专著的副主编；参与7本专著的编写(包括CancerMetastasis等3本英文专著)。

获国家自然科学二等奖(2010)、上海市科技精英(2013)、上海市自然科学牡丹奖(2010)、上海市自然科学一等奖(2009)、教育部自然科学一等奖(2007)、国家科技进步一等奖(2006)、上海市自然科学二等奖(2000)和上海市卫生系统银蛇奖等多项奖励。先后二十余次在国际学术会议、三十余次在国内学术会议作特邀报告。担任三届“全国肿瘤转移学术大会”主席及“首届东方肿瘤分子诊断与治疗学术大会”主席,并带领中国抗癌协会肿瘤转移专业委员会与国际肿瘤转移研究会(MRS)联合举办两届“国际肿瘤转移学术大会”。

Testing methodology for the vibration in basilar membrane of guinea pig′s cochlea

ZHOU Lei1,XU Li-fu2,TA Na2,RAO Zhu-shi2,HUANG Xin-sheng1△

(1DepartmentofENT,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2InstituteofVibration,ShockandNoise-StateKeyLaboratoryofMechanicalSystemandVibration,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China.)

【Abstract】ObjectiveTo explore a method to measure the vibration in basilar membrane of guinea pig′s cochlea.MethodsGuinea pig was under pentobarbital anesthesia by intraperitoneal injection throughout the experiments.We made a ventrolateral incision and dissected the muscles.Then the bulla could be seen at the deep side of the mandible.The bulla was exposed by scraping the muscles on its surface,and was opened by electric drill.After the location of the basilar membrane was distinguished,a circle ditch was drilled gradually on corresponding bony wall.Then a fine hole of the bony wall could be done by openng this small piece isolated bony wall with a pointed scalpel.The reflected glass beads were placed on the basilar membrane using a pointed stainless needle.Then the laser doppler vibrometer (LDV) was used to record the vibration in basilar membrane under pure tone stimulation from the outer ear.ResultsWe measured the response curve of basilar membranem in guinea pig′s cochlea under sound stimulation of different frequencies.ConclusionsThis method can be used to measure the vibration in basilar membrane of guinea pig′s cochlea in vitro,while in vivotest may need further research.

【Key words】cochlea;basilar membrane;laser doppler vibrometer;guinea pig;vibration

【中图分类号】R318.01; TB 532

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.013

(收稿日期:2015-04-10;编辑:王蔚)

国家自然科学基金 (81170910,11072145)

△Corresponding authorE-mail:huang.xinsheng@zs-hospital.sh.cn