吡格列酮通过pCREB蛋白对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制的研究

2015-07-19忽海洋马文艳刘亭亭陈还珍

中西医结合心脑血管病杂志 2015年2期

忽海洋,白莉,马文艳,刘亭亭,陈还珍

忽海洋,白莉,马文艳,刘亭亭,陈还珍

目的通过检测大鼠心肌缺血再灌注p-CREB蛋白表达的变化,探讨吡格列酮对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制。方法将55只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、吡格列酮组、吡格列酮+GW9662组,左前降支结扎的方法建立缺血再灌注损伤模型,伊文思蓝染色测定心肌梗死面积,Western blot法测定心肌组织p-CREB蛋白表达。结果吡格列酮组梗死面积与缺血再灌注组比较明显减少(P<0.05),与吡格列酮组比较,吡格列酮+GW9662组梗死面积差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组和缺血再灌注组相比,吡格列酮组p-CREB蛋白表达明显增加(P<0.05),吡格列酮+GW9662组p-CREB蛋白表达无明显变化(P>0.05);与吡格列酮组相比,吡格列酮+GW9662组p-CREB蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论吡格列酮可能上调p-CREB蛋白表达进而抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤,GW9662可逆转吡格列酮对心肌细胞的保护作用。

缺血-再灌注损伤;吡格列酮;p-CREB蛋白

随着临床上对于急性冠脉综合征的溶栓、介入、冠状动脉搭桥等治疗的广泛应用,使冠心病的治疗进入再灌注时期,冠状动脉再通后都将直接面临心肌缺血再灌注损伤(MIRI)等重大的临床问题。研究发现细胞凋亡在细胞再灌注损伤中发挥重要作用,抗凋亡机制可能是减轻再灌注损伤的新方法。既往发现噻唑烷二酮类药物对缺血再灌注损伤有保护作用,主要是减轻心肌细胞凋亡[1,2]。CREB是环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)应答元件结合蛋白的简称,对细胞的增殖、再生起重要的作用。最初发现CREB与学习及记忆功能有密切关系,近年研究显示p-CREB对循环系统也发挥重要作用[3]。但关于吡格列酮在缺血再灌注时p-CREB蛋白表达的影响报道较少。本实验在原有研究基础上,观察过氧化物酶体增殖物激活受体-r(peroxisome proliferators-act-i vated receptor-r,PPARr)激活剂吡格列酮对大鼠缺血再灌注(I/R)心肌p-CREB蛋白表达的影响,以进一步探讨吡格列酮抗缺血再灌注损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂盐酸吡格列酮片由日本武田药品工业株式会社生产;GW9662由Pfizer辉瑞公司生产;伊文思蓝由江莱生物公司生产;环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白一抗由Cell Signal公司生产。

1.2 实验动物及分组健康雄性SD大鼠55只,体重250 g～300 g,山西医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分成4组。假手术组(10只):生理盐水2 mL/d灌胃;缺血再灌注组(15只):生理盐水2 mL/d灌胃;吡格列酮组(15只):吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃;吡格列酮+过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)特异性阻断剂GW9662组(吡格列酮+GW9662组, 15只):吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃,缺血再灌注前30 min静脉注射GW9662。各组灌胃2周后制作大鼠在体心肌I/R模型。假手术组只开胸穿线,不结扎冠状动脉。

1.3 方法

1.3.1 模型建立[4]腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠(3 mL/kg),心电图监测。切开气管进行插管,调整吸呼比1∶2,通气频率60次/min。暴露心脏后在冠状动脉根部1 mm～2 mm处用带6/0线的眼科针穿过肺动脉窦和左心耳之间,垫一塑料管后用止血钳夹紧,观察左室前壁心肌颜色及心电图动态演变。心肌组织颜色变暗或心电图ST段抬高或下降,判断为结扎成功。缺血30 min后放松结扎部位,使冠状动脉再通120 min。再灌完成后剪下心脏,液氮冷冻心室前壁留取的组织,检测心肌梗死面积及提取蛋白质。假手术组只穿线但不结扎冠状动脉,暴露心脏150 min。

1.3.2 心肌梗死面积测定[5]除假手术组外每组各取大鼠5只,再灌注完成后重新结扎先前部位,用2%的伊文思蓝2 mL经腹腔静脉注入,使心脏染色以区分非缺血区(蓝染区)和缺血区(非蓝染区),迅速取下心脏,剪去心房和右室后无菌纱布吸干表面水分,放入-20℃冷藏,沿长轴切成1 mm～2 mm的薄片5张,将切片浸入1%TTC的磷酸缓冲液中(pH值7.4)37℃孵育30 min,再用10%的甲醛固定24 h以增强染色颜色对比,照相。心肌组织分为:蓝色为正常心肌,浅红色为缺血未梗死心肌,灰白色为梗死心肌。通过计算机图像分析软件计算梗死心肌占左室面积百分比(IR/LV)。

1.3.3 Western blot法测定p-CREB蛋白表达提取心肌组织匀浆液,用BCA法检测蛋白定量,进行蛋白制样,配制SDS-PAGE凝胶,然后提取上样量40 g/lane,采用BIO-RAD电泳系统80 V 45 min浓缩, 100 V 80 min进行电泳分离。转膜200 mA 2 h、5%脱脂奶粉封闭,加入cAMP反应元件结合蛋白一抗,稀释浓度为1∶10 000,加入二抗进行杂交2 h,化学发光显色,按相对比值进行相对定量,即各蛋白目的条带光密度相对强度=各蛋白目的条带灰度值/假手术组蛋白目的条带灰度值。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间数据比较采用ANOVA检验,两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较吡格列酮组梗死面积与缺血再灌注组比较明显减小(P<0.05),吡格列酮+GW9662组梗死面积与缺血再灌注组比较差异无统计学意义(P>0.05);与吡格列酮组比较,吡格列酮+GW9662组梗死面积差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(±s)%

组别n 心肌梗死面积缺血再灌注组1023.69±0.74吡格列酮组1013.73±0.781)吡格列酮+GW9662组1021.68±0.712)与缺血再灌注组相比,1)P<0.05;与吡格列酮组相比, 2)P<0.05。

2.2 Western blot法分析p-CREB蛋白表达与假手术组比较,缺血再灌注组p-CREB蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与缺血再灌注组比较,吡格列酮组p-CREB蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而吡格列酮+GW9662组p-CREB蛋白表达无明显变化;与吡格列酮组比较,吡格列酮+ GW9662组p-CREB蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组p-CREB/βactin蛋白谱带密度相对值比较(±s)

组别n pCREB/βactin假手术组100.057 2±0.033 9缺血再灌注组100.115 1±0.028 0吡格列酮组100.542 3±0.059 01)吡格列酮+GW9662组100.252 1±0.112 12)与缺血再灌注组相比,1)P<0.05;与吡格列酮组相比, 2)P<0.05。

3 讨论

在抢救缺血再灌注损伤心肌的同时也会带来心肌的损伤,目前最重要的是为缺血心肌从再灌注治疗中取得最佳疗效。炎症介质及氧自由基在再灌注损伤中起重要作用,如何防治缺血再灌注损伤已成为目前研究的主要内容[5]。近年来临床上药物及缺血预适应等用来保护再灌注损伤的心肌,有明显抑制缺血再灌注心肌凋亡的作用[6]。由于缺血再灌注过程有着复杂的细胞信号转导机制,涉及细胞外、细胞膜、细胞内信号通路及其效应器等多种的变化,有着多环节、多层次的交互作用。继续研究再灌注损伤过程的细胞分子机制,对临床防治缺血再灌注损伤提供新的思路[7]。

噻唑烷二酮类药物是PPAR激活剂作为胰岛素增敏剂,降低胰岛素抵抗来治疗2型糖尿病[8]。有研究证明,吡格列酮可以增加Bcl-2的表达,抑制凋亡相关蛋白Bax的表达,与剂量依赖性相关,从而减少缺血-再灌注心肌细胞凋亡[9]。有研究发现,CREB对于心肌细胞神经母细胞瘤细胞和胰腺B细胞等发挥抗凋亡作用[10]。本实验采用Western blot法检测了p-CREB的表达,结果发现吡格列酮预处理能够增加p-CREB蛋白表达,提示吡格列酮可能通过上调p-CREB蛋白表达而发挥抗心肌凋亡作用。短期给予吡格列酮治疗后,能减轻心肌缺血再灌注后的病理损伤及减少细胞的凋亡,改善心功能,对缺血再灌注损伤起到了保护的作用,给予GW9662后p-CREB蛋白的表达降低。因此,推测吡格列酮可能通过PPAR途径介导使p-CREB蛋白表达增加而抑制了心肌细胞凋亡。

吡格列酮减轻心肌缺血再灌注损伤机制可能与其上调p-CREB蛋白的表达有关,提示p-CREB蛋白通路可能是吡格列酮发挥心肌保护作用的信号途径之一。然而,对于吡格列酮如何通过p-CREB蛋白途径减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制还需要进一步的实验研究,为吡格列酮的临床应用提供新的理论依据。

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R542.2R256.2

:Adoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.021

:1672-1349(2015)02-0193-03