小鼠出生后早期耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞形态的变化

杨卫平许阳胡博华杨仕明

1中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部（北京 100853）

2国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心（北京 100853）

3聋病教育部重点实验室（北京 100853）

4聋病防治北京市重点实验室（北京 100853）

5解放军总医院呼吸科（北京 100853）

6美国纽约州立布法罗大学听力及聋病研究中心(NY 14214 USA）

耳蜗柯蒂氏器是听觉器官的声电转换器，负责声音的感知，主要由毛细胞和支持细胞组成。毛细胞对各种损伤因素极为敏感，细胞损伤引起耳蜗的炎性和免疫反应[1-3]。

免疫细胞是免疫系统的一个重要组成成分。在稳态情况下，耳蜗的组织巨噬细胞分布于耳蜗不同区域，包括螺旋神经节、螺旋韧带、螺旋缘、骨螺旋板、血管纹等[4-6]。在耳蜗的感觉上皮，免疫细胞存在于耳蜗基底膜的鼓阶面[7-9]。噪声暴露后1天，循环的单核细胞浸入耳蜗基底膜鼓阶面组织，3～7天浸入细胞数量达到高峰。这些细胞转变为巨噬细胞，参与各种炎性和免疫活动[10]。

耳蜗柯蒂氏器表达多种免疫介质，推论其具有较强的免疫功能[11]。然而在生理条件下，耳蜗基底膜中阶面柯蒂氏器是否存在组织巨噬细胞仍不明确。O'Malley等发现，在耳蜗柯蒂氏器Hensen细胞下存在巨噬细胞免疫蛋白标记物[12]。但其他研究者报道，耳蜗柯蒂氏器缺少免疫细胞[13,14]。耳蜗柯蒂氏器是听觉的主要器官，揭示免疫细胞对耳蜗柯蒂氏器的免疫作用具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验选用C57BL/6J小鼠，雌雄各半，出生后1～4 周龄 (出生后 6～7d，10d，14d，17d，21d，28d)每组动物至少4～5只。种鼠购买于美国缅因州巴港杰克逊实验室，小鼠繁殖、饲养于美国纽约州立布法罗大学实验动物中心，动物的使用和实验程序得到布法罗大学动物管理委员会的批准。

1.2 CD45和F4/80免疫标记耳蜗基底膜

CO2吸入麻醉后处死动物，取出小鼠双侧耳蜗，于10%福尔马林缓冲液4℃固定耳蜗过夜，在10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）中分离耳蜗基底膜。用0.5%Triton X-100和10%驴或山羊血清白蛋白在室温下作用1 h后，用山羊CD45多克隆抗体（1:200，AF114，RD Inc.，USA）或大鼠抗F4/80单克隆抗体（CI:A3-1）（1:150，ab6640，Abcam Inc.，USA）孵育组织，4℃过夜。二抗孵育组织，CD45染色：Alexa-Fluor®488驴抗山羊IgG(1:200,10 mM PBS稀释，Invitrogen），F4/80染色：Alexa-Fluor®488或594驴抗鼠IgG（1:100，10 mM PBS稀释，Invitrogen)，10 mM PBS清洗组织。

1.3 细胞质膜和细胞核染色

用3,3′-二十八碳杂菁高氯酸盐（DiO，Invitrogen，Inc.）染色细胞质膜。将DiO溶解在N，N-二甲基甲酰胺（DMF，Fisher Scientific，D119-500）中配制DiO染色液（10 μM）。将固定后分离的耳蜗基底膜组织置于DiO溶液中，室温孵育2 min，PBS冲洗。用碘化丙锭（PI）标记细胞核[2]。

1.4 耳蜗基底膜组织观察与图像采集

按照荧光显微镜观察和计算机图像分析方法[15]，对样本进行拍照，处理图像，测量耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞直径。

1.5 统计学处理

SigmaStat Version3.5软件(美国)用于分析统计的数据。比较不同周龄小鼠耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞直径采用t检验分析，各组数据以表示，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 耳蜗基底膜的中阶面存在CD45阳性反应细胞

为确定耳蜗基底膜中阶面是否存在CD45阳性反应细胞，及免疫细胞形态、分布特点，我们首先对4周龄小鼠耳蜗感觉上皮组织进行了CD45染色。结果发现，在耳蜗基底膜的中阶面存在CD45阳性标记细胞。这些细胞在顶回的顶部呈不规则形，细胞体积较大，约50～70 µm(图1A，左1-2)，细胞质伸出突起多呈钝圆形。其它部位多数细胞细长，类似E或F形（图1A，左3-4)，其长轴与耳蜗长轴平行，开口于耳蜗外侧壁或蜗轴，细胞体积自耳蜗基底膜的顶回到底回逐渐减小。细胞沿耳蜗基底膜长轴排列为一排，间隔约为30～40µm，细胞间隔自耳蜗基底膜的顶回到底回逐渐增大（图1B)。

为对比耳蜗基底膜中阶面与鼓阶面组织巨噬细胞形态和分布的区别，我们同时观察了耳蜗基底膜鼓阶面的CD45阳性细胞形态。这些细胞分散排列在全耳蜗基底膜，耳蜗的顶回呈树枝状，中回呈树干状，底回呈变形虫状，细胞形态与分布与我们之前的报道相同[7]。

图1 CD45阳性标记的4周龄小鼠耳蜗基底膜中阶面细胞的形态和分布。A:典型细胞形态。B:细胞在耳蜗基底膜的分布。箭头示CD45阳性标记细胞。标尺：40µm。Fig.1 The morphology and distribution of CD45 positive cells in the scala media side of the basilar membrane of 4-week-old mice.A:Typical images of cell morphology.B:Distribution of cells in the basilar membrane of the cochlea.Arrows indicate the CD45 positive cells.Bars:40µm.

2.2 耳蜗基底膜中阶面CD45阳性细胞为巨噬细胞

为鉴别耳蜗基底膜中阶面CD45阳性细胞，揭示CD45阳性细胞是否表达巨噬细胞专有蛋白，我们对部分耳蜗基底膜组织进行了CD45和F4/80双重染色。发现CD45阳性细胞存在F4/80免疫反应（图2A-C)，表明CD45阳性细胞为巨噬细胞表型；为证明CD45阳性细胞是否存在质膜，我们采用CD45和DiO(一种亲脂的示踪剂）双重染色部分耳蜗基底膜。发现DiO免疫荧光反应定位于CD45阳性细胞（图2D-F)，表明CD45阳性细胞具有膜结构；为鉴定CD45阳性细胞是否存在细胞核，我们对部分耳蜗基底膜进行了CD45和PI双重染色。发现CD45阳性细胞PI染色阴性（图2G-I)，证明这些细胞缺少细胞核。以上结果表明，4周龄小鼠耳蜗基底膜中阶面存在无核的巨噬细胞。

图2 耳蜗基底膜中阶面CD45阳性细胞的鉴别。A：CD45染色，B：F4/80染色，C：CD45与F4/80双重染色；D：CD45染色，E：DIO染色，F：CD45与DIO双重染色；G：CD45染色，H：PI染色，I：CD45与PI双重染色。箭头示耳蜗基底膜中阶面巨噬细胞。标尺:10 μm。Fig.2 Identification of CD45 positive structures in the scala media side of the basilar membrane of cochlea.A:CD45 immunolabeling.B:F4/80 immunoreactivity.C:Merged image of CD45 and F4/80 immunolabeling.D:CD45 immunolabeling.E:DiO immunoreactivity.F:Merged image of CD45 and DiO immunolabeling.G:CD45 immunolabeling.H:PI staining.I:Merged image of CD45 and PI staining.Arrows indicate the CD45 positive structures.Bars:10µm.

2.3 柯蒂氏器巨噬细胞定位于耳蜗基底膜的Hensen与Claudius细胞之间

耳蜗柯蒂氏器细胞具有独特的形状和位置，为揭示CD45阳性细胞与耳蜗柯蒂氏器细胞的空间分布关系，我们用CD45和DiO双重标记耳蜗基底膜细胞。荧光显微镜下观察到Hensen细胞呈大而无规律形，Claudius细胞呈多边形，CD45阳性细胞定位于Hensen细胞与Claudius细胞连接处（图3)。

图3 CD45和DiO双重染色定位耳蜗基底膜中阶面巨噬细胞。箭头示巨噬细胞。标尺:10 μm。Fig.3 Double staining with CD45 and DiO for location of macrophages in the scala media side of cochlear basilar membrane.Arrow indicates macrophage.Bar:10 μm.

2.4 耳蜗基底膜中阶面巨噬细胞与鼓阶面巨噬细胞定位无相关性

为揭示耳蜗基底膜中阶面巨噬细胞与鼓阶面巨噬细胞的定位关系，我们对耳蜗基底膜CD45染色发现，定位于耳蜗基底膜中阶面无核的CD45阳性巨噬细胞（图4箭头所示)与定位于耳蜗基底膜鼓阶面CD45阳性巨噬细胞（图4三角所示)的分布不相关。

图4 CD45染色的耳蜗基底膜中阶面和鼓阶面巨噬细胞的分布。箭头示中阶面柯蒂氏器巨噬细胞，三角示鼓阶面巨噬细胞。标尺:40 μm。Fig.4 The distribution of macrophages in the scala media side and scala tympani side of the basilar membrane of cochlea stained by CD45.Arrows indicate macrophages in the scala media side,and triangles indicate macrophages in the scala tympani side.Bar:40 μm.

2.5 耳蜗柯蒂氏器的无核巨噬细胞自出生后有核巨噬细胞转变而来

为揭示耳蜗基底膜中阶面柯蒂氏器无核巨噬细胞的来源，我们检查了出生后1～2周的小鼠耳蜗。在这个发育阶段，CD45染色的耳蜗基底膜顶部、中部和底部都能够检测到巨噬细胞。CD45与PI双重染色发现，出生后1～2周的小鼠柯蒂氏器巨噬细胞存在细胞核（图5A)。

为揭示有核巨噬细胞在耳蜗的存在时间，我们检查了出生后2～3周小鼠耳蜗。发现出生后第17天小鼠耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞部分存在细胞核，而另一部分细胞的细胞核消失（图5B)。表明小鼠耳蜗柯蒂氏器无核巨噬细胞源自出生后有核巨噬细胞,出生2周后开始出现细胞核消失。

图5 CD45与PI双重标记的小鼠出生后早期耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞。A：出生后10 d柯蒂氏器巨噬细胞，B:出生后17 d柯蒂氏器巨噬细胞，单箭头示耳蜗柯蒂氏器无核的巨噬细胞，双箭头示耳蜗柯蒂氏器有核的巨噬细胞。标尺:20 μm。Fig.5 Macrophages in the organ of Corti of cochleae during early postnatal mice staining with CD45 and PI.A:Macrophages at postnatal day 10.B:Macrophages at postnatal day 17.Arrow indicates an anucleated macrophage.Double arrows indicate ucleated macrophages.Bar:20 μm.

2.6 小鼠出生后早期耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞形态和分布的变化

显微镜下观察CD45染色的耳蜗基底膜中阶面柯蒂氏器巨噬细胞发现，出生后6 d小鼠巨噬细胞轮廓清晰，1～2周龄巨噬细胞形态多样，细胞体积较大，多个指状或锥形突起，细胞核呈卵圆形，耳蜗基底膜顶回的柯蒂氏器巨噬细胞稍大于中回和底回。细胞自耳蜗基底膜顶回到底回分布均一（图6A-F）。

3周龄小鼠耳蜗基底膜顶回柯蒂氏器巨噬细胞呈不规则形，其体积、形态与1～2周龄小鼠中回细胞相似。中回和底回柯蒂氏器巨噬细胞多数呈细长形，伪足较1～2周龄小鼠细胞数量少，突起细而短（图6G-I）；4周龄小鼠耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞体积存在差异，耳蜗基底膜顶回顶部细胞比较大，突起短。中回细胞细长，底回细胞变细、变短,或者消失（图6J-L）。

不同周龄小鼠耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞长轴平均直径比较发现，3～4周龄小鼠柯蒂氏器巨噬细胞自耳蜗基底膜的顶回、中回到底回逐渐变小(58.7±10.7 μm,48.2±8.9 μm,42.6±5.6 μm)，其细胞直径均小于出生后1～2周小鼠(69.8±7.3 μm,59.2±13.2 μm,57.8±11.2 μm)，两者存在明显差异P＜0.05（P=0.006,P=0.043,P=0.001，t检验，图6M）。

图6 出生后早期小鼠耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞形态变化。A-L：CD45染色的柯蒂氏器巨噬细胞，箭头示典型的细胞形态，标尺:50µm。M：出生后不同周龄小鼠耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞长轴直径比较。*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001。每组8个耳蜗。Fig.6 Changes of morphology of macrophages in the organ of Corti of cochleae during early postnatal mice.A-L:Macrophages staining with CD45.Arrows indicate typical images of macrophages.Bar:50µm.M:Comparison of the average length of the long-axis of macrophages in the organ of Corti in different weeks of early postnatal mice.*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001.n=8 cochleae for each group.

3 讨论

本研究主要发现：1）出生后早期小鼠耳蜗基底膜的中阶面柯蒂氏器存在形态多样的组织巨噬细胞。2）当柯蒂氏器发育成熟时，这些巨噬细胞出现发育性死亡，遗留下无核的巨噬细胞残体。3）小鼠耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞的形态和分布特点与耳蜗基底膜鼓阶面巨噬细胞不同。

本实验观察到出生后早期小鼠耳蜗基底膜柯蒂氏器下Hensen与Claudius细胞之间存在巨噬细胞，这些细胞出生时已经发育成熟，但其寿命很短，伴随感觉上皮的成熟出现发育性退化。O'Malley等曾采用免疫组织化学方法在52～88岁无增龄相关耳蜗病变人的火棉胶包埋颞骨组织切片中观察到，耳蜗柯蒂氏器Hensen细胞下存在巨噬细胞标记物[12]，我们的发现与O'Malley关于柯蒂氏器巨噬细胞定位相同。不同的是我们观察到小鼠出生后17天开始出现柯蒂氏器巨噬细胞核消失，而O'Malley等发现，老年人耳蜗存在柯蒂氏器巨噬细胞。该研究结果不一致的解释：1）被收集的个体组织存在差别，我们的实验对象为出生后早期小鼠耳蜗，O'Malley等观察的是52～88岁人类颞骨。2）研究方法不同，我们采用的是巨噬细胞蛋白标记物和细胞核DNA染料双重染色耳蜗基底膜，O'Malley等仅采用巨噬细胞蛋白标记物染色耳蜗基底膜，不能观察到细胞核的变化。

我们前期报道了小鼠耳蜗基底膜鼓阶面巨噬细胞的形态、分布特点[7]，本研究观察了小鼠耳蜗基底膜中阶面巨噬细胞的形态、分布特点，及出生后早期形态学变化。发现耳蜗基底膜柯蒂氏器巨噬细胞与耳蜗基底膜鼓阶面巨噬细胞存在以下异同点：1）两者都属于耳蜗基底膜组织巨噬细胞，中阶面柯蒂氏器巨噬细胞存在于毛细胞下的支持细胞间隙，鼓阶面巨噬细胞存在于基底膜鼓阶面的表层[7]。2）柯蒂氏器巨噬细胞源自耳蜗基底膜胚胎衍生的细胞，出生后一周细胞轮廓清晰；基底膜鼓阶面巨噬细胞源自耳蜗基底膜胚胎衍生的细胞及耳蜗血管内单核细胞的渗入[7]。3）柯蒂氏器巨噬细胞伴随耳蜗发育成熟而死亡，基底膜鼓阶面巨噬细胞终生存在[15]。4）柯蒂氏器巨噬细胞出生后1～2周，体积大，突起长，形状多样性。生后3～4周细胞残体除耳蜗基底膜顶回顶部细胞呈不规则形状外，其余部分形似E和F形；耳蜗基底膜鼓阶面的巨噬细胞出生时呈现单核细胞形状，这些细胞在生后发育中历经了专一位点分化，并将其形态保持至成年。顶回巨噬细胞呈树枝状，中回细胞呈短突起的树干状，底回细胞进一步分化为变形虫形[7]。5）柯蒂氏器巨噬细胞与鼓阶面巨噬细胞定位不相关。柯蒂氏器巨噬细胞自耳蜗基底膜顶回到底回单行排列，基底膜鼓阶面巨噬细胞分散排列。6）噪声暴露后渗入的单核细胞仅存在于基底膜鼓阶面[7]。鉴于以上比较分析，推论耳蜗基底膜中阶面柯蒂氏器巨噬细胞与鼓阶面巨噬细胞可能存在不同的生物学功能。

耳蜗组织巨噬细胞除产生炎性因子[16]，抗原的呈递外[10]，吞噬作用是巨噬细胞的重要功能之一，耳蜗组织巨噬细胞吞噬和清除衰老、损伤细胞碎片[17]。小鼠出生时耳蜗膜迷路的大部分结构已经形成，但发育并未成熟，其发育过程延续至出生后2周[18]。在这一阶段，感觉上皮历经几个重要的结构修饰，包括除去感觉上皮多余的细胞，螺旋血管的重建，柯蒂淋巴腔的形成，及感觉细胞与神经元连接的细微变化，这些结构的重塑需要从耳蜗清除多余的细胞。耳蜗感觉上皮的成熟过程自耳蜗基底膜底回到顶回发展，与耳蜗功能的成熟过程相一致。本实验发现，出生后6天柯蒂氏器巨噬细胞分化形态成熟，可能存在功能。此外，柯蒂氏器巨噬细胞临近的组织历经了发育结构的变化，而柯蒂氏器巨噬细胞保持自身活力直到感觉上皮发育结束，柯蒂氏器发育成熟后，这些巨噬细胞出现发育性死亡。值得注意的是柯蒂氏器巨噬细胞发育性退变过程从底回到顶回，其与耳蜗基底膜感觉上皮的成熟从底回到顶回的发展过程相一致。这些发现提示，柯蒂氏器巨噬细胞可能参与了耳蜗基底膜感觉上皮的发育过程。