胃安颗粒微生物限度检查方法的验证*

郑兆银，陈延晶，贺 蕾

(天津市静海县药品检验所，天津 301600)

实验研究

胃安颗粒微生物限度检查方法的验证*

郑兆银，陈延晶，贺 蕾

(天津市静海县药品检验所，天津 301600)

目的:建立胃安颗粒微生物限度检查方法。方法:按《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法及应用指导原则［1］，考察确定胃安颗粒微生物限度的检查方法。用常规法进行预试验，初步考察该样品对试验菌检测的影响，根据结果，用培养基稀释法进行再试验。结果:常规法试验，大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%，而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均小于70%，控制菌检查采用常规法。采用培养基稀释法试验时，可以有效消除抑菌作用，使金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率大于70%。结论:采用培养基稀释法可以有效消除抑菌作用，简便、准确。

微生物限度检查，验证试验，培养基稀释法

胃安颗粒是一复方中成药制剂，由丹参、马鞭草、蚕砂、石斛、太子参、白术、连翘、豆蔻、砂仁、蜂房、甘松、梅花和拳参组成，临床上健脾益胃、化瘀行滞，用于萎缩性胃炎或不典型增生及残胃炎。《中国药典》2010年版规定［1］，在进行药品微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。

1 试验材料与仪器

1.1 样品 胃安颗粒(某医院制剂;批号20110916;规格:5 gx10袋/盒)。

1.2 仪器 GZX－9240MBE型数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、DHP－9162型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)、MJ－250BS－II型霉菌培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)、SPX－250B生化培养箱(天津市华北实验仪器有限公司)、RS－1型涡旋仪(北京昊诺斯科技有限公司)、LDZX－50FBS型蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)等。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］;大肠埃希菌［CMCC(B)44102］;枯草芽孢杆菌;［CMCC(B)63501］白色念珠菌［CMCC(F)98001］;黑曲霉［CMCC(F)98003］;乙型副伤寒沙门菌［CMCC(B)50094］均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基及稀释剂 营养琼脂培养基;玫瑰红钠琼脂培养基;胆盐乳糖培养基;营养肉汤培养基;改良马丁培养基;pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、MUG培养基;胆盐乳糖发酵培养基;四硫磺酸亮绿培养基;麦康凯琼脂培养基;胆盐硫乳琼脂培养基;三糖铁琼脂培养基;改良马丁琼脂培养基。

2 验证条件

无菌室环境洁净度为100 00级，局部洁净度为100级，净化消毒30 min以上，供试品及灭菌的器具等经传递窗紫外杀菌灯照射30 min置无菌室内，试验人员手消毒后穿无菌服进入操作间。

3 验证试验

3.1 试验菌液的制备 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24 h;取白色念珠菌的新鲜培养物，接种至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数约为50～100 cfu的菌悬液。取黑曲霉的新鲜斜面培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，25℃培养5～7 d，加入3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液溶液，将孢子洗下脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。

3.2 供试品溶液的制备 称取样品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 ml，振摇使分散均匀，制成1∶10的供试液。

3.3 细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法的验证

3.3.1 常规法 ①试验组:分别吸取1∶10供试液1 ml和含菌数为50－100 cfu的试验菌液1 ml置同一个无菌平皿中。②菌液组:吸取含菌数为50～100 cfu的试验菌液1 ml置无菌平皿中。③供试品对照组:吸取1∶10供试液1 ml置无菌平皿中。每组平行制备2个平板，分别立即倾注不超过45℃的营养琼脂培养基15～20 ml，在30～35℃培养48 h，或分别倾注不超过45℃的玫瑰红钠琼脂培养基15～20 ml，在23～28℃培养72 h，点计菌落数，分别计算各试验菌每次试验的菌回收率。试验组菌回收率计算:菌回收率(%)=(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)∕菌液组平均菌落数。结果见表1。

由表1可知，常规法3次试验中，大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉在供试液中回收率均大于70%;金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在供试液中回收率均小于70%。说明常规法适合于该品种的霉菌及酵母菌计数，但不适合于本品的细菌计数。根据上述情况，采用培养基稀释法进行再试验

3.3.2 培养基稀释法 取1∶10供试液1 ml分别加入5个无菌平皿中(每皿0.2 ml)，其他同于常规法。试验组菌回收率计算:菌回收率(%)=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)∕菌液组平均菌落数。结果见表2。

表1 常规法测定胃安颗粒的细菌数、霉菌及酵母菌数回收率结果

表2 培养基稀释法测定胃安颗粒菌回收率结果

由表2可知，采用培养基稀释法后，可消除供试液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。说明培养基稀释法(每皿0.2 ml)适合于该品种的菌落计数。

3.4 控制菌检查方法的验证

3.4.1 验证方法

3.4.1.1 试验组 取规定量1∶10供试液及含菌数为10～100 cfu试验菌液1 ml加入增菌培养基中。

3.4.1.2 阴性菌对照组 取规定量供试液及含菌数为10～100 cfu金黄色葡萄球菌菌液1 ml加入增菌培养基中。

3.4.1.3 阳性对照组 取含菌数为10～100 cfu的试验菌液1 ml加入增菌培养基中。

3.4.1.4 供试品对照组 取1∶10供试液，加入到增菌培养基中。

3.4.2 大肠埃希菌检查方法的验证 取1∶10供试液10 ml接种至100 ml胆盐乳糖培养基，置30～35℃培养18～24 h。吸取上述培养物0.2 ml，接种至含5 ml MUG培养基的试管内，培养。于5和24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性;不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性;呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如MUG阳性，靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。结果见表3。

表3 大肠埃希菌检查方法验证结果

由表3可知，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌，试验组与阳性对照组均检出大肠埃希菌，大肠埃希菌检查可用常规法检查。

3.4.3 大肠菌群检查方法的验证 取1∶10、1∶100和1∶1 000的供试液各1 ml分别加入含10 ml胆盐乳糖发酵培养基的管中，30～35℃培养18～24 h。若不产气产酸，判未检出大肠菌群。若产气产酸，将发酵管中的培养物分别划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，培养18～24 h。从分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48 h，若产气产酸判检出大肠菌群。结果见表4。

表4 大肠菌群检查方法验证结果

由表4可知，阴性菌对照组未检出大肠菌群，试验组与阳性对照组均检出大肠菌群，大肠菌群检查可用常规法检查。

3.4.4 沙门菌检查方法的验证 取供试品10 g，接种至200 ml营养肉汤培养基中，振摇混合，30～35℃培养18～24 h。取上述培养物1 ml，接种于10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24 h后，分别划线接种于胆硫乳琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基平板上，培养18～24 h，若平板上无菌落生长或无疑似菌落生长，判供试品未检出沙门菌。否则，用接种针挑选2～3个疑似菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24 h。斜面见红色，底层见黄色，或斜面黄色、底层黑色判检出沙门菌。结果见表5。

表5 沙门菌检查方法验证结果

由表5可知，阴性菌对照组未检出沙门菌，试验组与阳性对照组均检出沙门菌，沙门菌检查可用常规法检查。

4 讨论

采用常规法试验时，该样品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的加菌回收率均大于70%，证明其对上述3种供试菌无抑菌作用。该样品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，其加菌回收率小于70%，低于《中国药典》2010年版规定的回收率不得低于70%才视为无抑菌作用的要求。结合该样品的物理特性和常规法试验结果，采用培养基稀释法进行试验后，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的加菌回收率可大于70%。故胃安颗粒的细菌数检查可采用培养基稀释法(0.2 ml)，霉菌及酵母菌数的检查采用常规法。

由控制菌检查方法的验证试验结果表明，采用常规法试验时，该样品对大肠埃希菌、大肠菌群和沙门菌的检查无干扰，故胃安颗粒的控制菌检查可采用常规法。

1 中国药典.一部.2010:附录79，138

Weian granules in verification of microbial limit test method

Zheng Zhaoyin，Chen Yanjing，He Lei
(The Insititute for Drug Control of Jinghai，Tianjin 301600)

Objective:to establish microbial Weian granules limit inspection Methods.Methods:according to the China Pharmacopeia(2010 edition a microbial limits inspection and application appendix guiding principle)，the investigation to determine the microbial limits stomach Ann particle inspection Methods.With conventional method on the test，a preliminary study samples of the experimental fungus effect on detecting，according to the results，with culture medium diluted method to test.Results:the normal method of test，escherichia coli，candida albicans，aspergillus are larger than the recovery rate of 70% ，and staphylococcus aureus and bacillus subtilis were less than the recovery rate of 70%，the conventional method check control bacteria.The culture medium diluted method test，can effectively eliminate the bacteriostatic action，make staphylococcus aureus，bacillus subtilis recovery rate of more than 70%.Conclusion:the culture medium diluted method can effectively eliminate the bacteriostatic action，is simple and accurate.

microbial limit inspection，validation test，culture medium diluted method

R927.11

A

1006-5687(2012)04-0001-03

2012-01-05