消除国产琼脂磷酸盐沉淀的工艺优化及设计

段博严，倪辉，2，3，李志朋，2，3，姜泽东，2，3，朱艳冰，2，3，李清彪，2，3

（1 集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021）

琼脂是从江蓠 （）、 石花菜（）、龙须菜（）等海洋红藻中提取胶质制成的一种长链形亲水多糖胶体，具备良好的胶凝能力、凝胶可逆性和高滞后性等性质，在食品工业、生物医药、日用化工等领域都有广泛应用。

目前，大部分琼脂产品都已经实现了国产化，但微生物培养基专用琼脂等产品尚未实现国产化生产。相关研究表明，配置微生物培养的生化琼脂要求良好的透明度，而国产琼脂配置微生物培养基时，加入磷酸盐后常出现浑浊或沉淀现象，导致透明度降低，影响微生物群落观察及计数。部分学者认为国产琼脂中存在钙、镁离子，在培养基配置时与磷酸盐反应生成不溶性沉淀，引起培养基浑浊度增加、透明度降低的“磷酸盐沉淀”现象。目前，常用去除钙、镁离子的方法有吸附法（adsorption method）、 化学沉淀法（chemical precipitation method）， 掩蔽剂法（screening reagent softening）、离子交换法（ion exchange process）、膜分离法（separation membrane）以及电渗析法（electrodialysis）等。黎新等研究发现分步沉淀法可有效去除钙离子，而镁离子无明显变化。Dong等研究发现产碱杆菌可通过胺化反应生成碳酸盐，从而去除海水中钙、镁离子。Sepehr 等研究发现改性沸石吸附法去除水中钙、镁离子。陈志林等发现在氯碱工业中以加入磷酸盐沉降钙、镁离子，可以显著去除钙、镁离子。王萍萍研究发现阳离子交换树脂可以显著降低琼脂中灰分含量。此外，相关研究还表明，在琼脂制备过程中采用烷基化法、羧烷基化法和缩水甘油醚法等改性处理也可以改善琼脂产品透明度。虽然研究人员对琼脂磷酸盐沉淀已经进行了一些研究，但国产琼脂产生磷酸盐沉淀的原因尚不完全明确，相关技术尚不能完全消除磷酸盐沉淀，国产琼脂磷酸盐沉淀问题尚未解决，导致微生物学计数用的生化琼脂大量依赖进口。

基于以上背景，本文根据相关研究报道，以Sigma 琼脂、国产琼脂条和国产琼脂粉为原料，以琼脂溶液添加磷酸盐后的透明度和浊度为评价指标，研究吸附法、掩蔽剂法和沉淀过滤法等对消除琼脂磷酸盐沉淀的效果，从琼脂原料和处理方法两个方面阐明生产生化琼脂的关键技术，并通过工艺设计评估该技术的经济可行性，为国产化制备高品质微生物培养基琼脂提供工艺方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

国产琼脂条和国产琼脂粉，绿新（福建）食品有限公司；Sigma-A6686琼脂粉，Sigma有限公司；活性沸石，青岛鹏润沸石矿物有限公司；3～5mm活性氧化铝球，龙鑫净水有限公司；AR 磷酸氢二钾、AR 氯化氢、AR 氯化钠、AR 氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；AR 乙二胺四乙酸（EDTA），上海恒信化学试剂有限公司。

PL602-S电子天平、FE20pH计，梅特勒-托多利仪器（上海）有限公司；ZXRB-B5210鼓风干燥箱、ZSBB-728 恒温水浴锅，厦门史维思技术服务有限公司；NN-GT353M 微波炉，松下电器（中国）有限公司；BXU-30R 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；WGZ-2000浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；V-T3 可见分光光度计，屹谱仪器制造（上海）有限公司；LXJ-IIB 离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 磷酸盐沉淀程度的测定

以料液比（质量比）1.5∶100 分别称取Sigma琼脂、国产琼脂粉和国产琼脂条1.5g，加入100mL去离子水后进行加热，充分搅拌溶解，制成琼脂样液，加入0.500g 磷酸氢二钾并用磷酸溶液调节pH至7.0～7.5，121℃高压灭菌20min，进行透明度和浊度测定。其中，透明度测定是将质量分数为1.5%的琼脂溶液趁热倒入比色皿中，室温放置24h，用紫外可见分光光度计测定750nm的透光率；浊度的测定是取适量样品溶液，冷却至85℃，倒入准备好的测试瓶中至刻度线位置，用浊度仪测定琼脂溶胶的浊度（NTU）。

1.2.2 活性沸石吸附法去除琼脂中磷酸盐沉淀的作用

根据相关文献[23]，以1mol/L NaCl+1mol/L NaOH 活化沸石，提高其吸附性能。称取1.5g 琼脂样品，加入100mL 去离子水，在100℃温度条件下水浴保温20min后，溶解后加入预热至60℃的活性沸石2g，80℃水浴振荡5min 后过滤，得到活性沸石处理后的样液。向处理后样液中加入0.500g磷酸氢二钾搅拌均匀，经121℃高压灭菌20min 后于100℃水浴中保温，测定其透明度及浊度。

1.2.3 活性氧化铝吸附法去除琼脂中磷酸盐沉淀的作用

将活性氧化铝用蒸馏水反复清洗至洗液透明，并浸泡20h 以上，热风干燥12h 后放于干燥器内保存。称取1.5g 琼脂样品，加入100mL 去离子水，在100℃温度条件下水浴加热20min 后，加入提前预热至60℃的活性氧化铝2g，在80℃温度条件下水浴振荡5min 后过滤，得到处理样液。向处理后样液中加入0.500g 磷酸氢二钾搅拌均匀，经121℃高压灭菌20min 后于100℃水浴中保温，测定其透明度及浊度。

1.2.4 EDTA掩蔽剂法去除琼脂磷酸盐沉淀的作用

称取1.5g琼脂样品，加入100mL去离子水，在100℃水浴中加热20min 后加入0.020g EDTA，100℃水浴30min，取出静置至完全凝固，用尼龙布包裹后压榨脱水，用20倍体积清水浸泡润洗3次，再次脱水后加水至总体积100mL，100℃加热熔化后加入0.500g 磷酸氢二钾搅拌均匀，经121℃高压灭菌20min 后于100℃水浴中保温，测定其透明度及浊度。

1.2.5 磷酸氢二钾沉淀法去除琼脂磷酸盐沉淀的作用

称取1.5g琼脂样品，加入100mL去离子水，在100℃水浴中加热20min 后加入0.500g 磷酸氢二钾在100℃下搅拌5min，静置10min 进行预沉淀。然后过滤得到处理样液，待静置凝固后用尼龙布包裹压榨脱水，用20倍体积清水浸泡润洗3次，总体积100mL，100℃加热熔化后加入0.500g 磷酸氢二钾搅拌均匀，经121℃高压灭菌20min后于100℃水浴中保温，测定其透明度及浊度。

1.2.6 数据分析方法

实验采用3 次平行实验，平均值为实验数据。利用Microsoft Office Excel 2019 软件进行平均值、标准偏差的计算。利用AutoCAD 2020 软件进行工艺流程图设计。

2 分析与讨论

2.1 活性沸石吸附法去除琼脂中磷酸盐沉淀的作用

活性沸石由于独特的微孔晶体结构及高比表面积，对多种金属离子具有最大吸附能力。活性沸石对Ca和Mg的吸附涉及两种基本机制：一种是用溶解的Ca和Mg替换游离沸石离子（Na）或部分结构离子，为表面络合过程；另一种是在离子交换作用减小后的静电吸引、化学结合和化学络合过程，为内部络合过程。研究表明，使用活性沸石对水中钙、镁离子去除率可达到70%和60%。根据相关报道，活性沸石吸附Ca和Mg的功能可能去除琼脂磷酸盐沉淀，但目前有关活性沸石处理对琼脂中磷酸盐沉淀影响的研究尚未报道。图1 显示，在未处理条件下，Sigma 琼脂的透明度明显高于国产琼脂条和国产琼脂粉；浊度显著低于国产琼脂条和国产琼脂粉，该结果说明国产琼脂条和琼脂粉的磷酸盐沉淀程度要高于Sigma琼脂。经过活性沸石处理后，Sigma 琼脂、国产琼脂条和国产琼脂粉的透明度都有所降低，Sigma 琼脂的浊度没有明显变化，国产琼脂条和国产琼脂粉的浊度有所降低。参照日本对生化琼脂中浊度应小于20NUT 的标准，活性沸石吸附法处理琼脂达不到生化琼脂的质量水平，也达不到Sigma 普通琼脂的质量水平。该结果说明活性沸石吸附法虽然对国产琼脂条和琼脂粉具有一定的降低浊度作用，但不能消除琼脂的磷酸盐沉淀。该现象的原因可能是琼脂中引起磷酸盐沉淀的成分除钙、镁离子外，还有其他成分；此外，琼脂溶液具有一定黏度，降低了沸石对钙、镁离子的吸附效果，这可能是另外一个原因。

图1 活性沸石处理对样液浊度及透明度的影响

2.2 活性氧化铝吸附法去除琼脂中磷酸盐沉淀的作用

活性氧化铝特殊的尖晶石结构使其具有高比表面积、高机械强度和良好的吸附性能。活性氧化铝对Ca和Mg吸附的基本机制包括静电吸引和离子交换，其中静电吸引适用于碱性环境，有利于吸附剂表面羟基的去质子化，这导致吸附剂表面呈负电性并通过静电引力将带正电的钙、镁离子吸附到带负电的吸附剂表面上；离子交换则是附着在吸附剂表面的游离离子（Na）有利于与钙、镁离子进行离子交换。有研究表明，活性氧化铝对水中钙、 镁离子去除率可达75.6% 和44.16%。Lorenzen 等研究表明，在pH 小于等于8.0，操作温度小于45℃时，活性氧化铝的吸附效果最佳。根据活性氧化铝吸附Ca和Mg的功能，推测其可能具有降低琼脂磷酸盐沉淀的作用，但目前有关活性氧化铝处理对琼脂中磷酸盐沉淀影响的研究尚未报道。图2 显示，经过活性氧化铝处理后，Sigma 琼脂、国产琼脂条和国产琼脂粉的透明度都比未处理有所降低，而Sigma琼脂的浊度没有明显变化，国产琼脂条和国产琼脂粉的浊度显著降低；该规律与图3所示的活性沸石处理后浊度和透明度变化规律相似，说明活性氧化铝吸附法不能有效降低琼脂磷酸盐沉淀。该现象的原因可能是琼脂中引起磷酸盐沉淀的成分复杂以及琼脂溶液的黏度影响了活性氧化铝对钙、镁离子的吸附效果。

图2 活性氧化铝处理对样液浊度及透明度的影响

图3 EDTA处理对样液浊度及透明度的影响

2.3 EDTA 掩蔽剂法去除琼脂中磷酸盐沉淀的作用

EDTA 作为一种氨基多元羧酸螯合剂拥有6 个配位点，分别位于2个氮原子及4个羧基上的氧原子，因此能较好地与大多数金属元素形成稳定的水溶性配合物。EDTA 去除Ca和Mg的机理可以概括为络合反应机理，如式(1)、式(2)所示。

加入EDTA 与琼脂溶液充分混合后，EDTA 与钙、镁离子发生络合反应生成可溶于水的钙、镁络合物，通过脱水将钙、镁络合物与琼脂溶液分离，进而达到去除琼脂中钙、镁离子的目的。如图3所示，经过EDTA 处理后琼脂样品的浊度显著降低，透明度显著提高（均大于等于94.7%）。该结果说明EDTA掩蔽剂法可有效降低琼脂磷酸盐沉淀的程度，这可能与其螯合琼脂溶液中多价金属离子的能力有关。经过EDTA 处理后，Sigma 琼脂、国产琼脂条及国产琼脂粉的浊度分别降低至53.61NTU、50.63NTU 和48.03NTU，参照日本对生化琼脂中浊度应小于20NUT的标准，仍然达不到生化琼脂的浊度标准要求；这说明EDTA掩蔽法处理可以显著降低琼脂磷酸盐沉淀，但尚达不到消除琼脂磷酸盐沉淀的效果。

2.4 磷酸氢二钾化学沉淀法去除琼脂中磷酸盐沉淀的作用

磷酸氢二钾易溶于水，水溶液呈弱碱性，其去除Ca和Mg的机理可以概括为化学沉淀反应机理，如式(3)～式(5)所示。

磷酸氢二钾与Ca及Mg发生化学反应，生成磷酸钙、磷酸氢钙及磷酸氢镁沉淀，从而去除钙、镁两种元素。如图4所示，经过磷酸氢二钾处理后，Sigma 琼脂、国产琼脂条及国产琼脂粉的浊度相比未处理都显著降低，透明度也都明显提高（均大于等于92.0%）。与掩蔽剂法相比，两种方法处理后透明度都显著提高；而在降低浊度方面，显然化学沉淀法优于掩蔽剂法。其中，Sigma 琼脂和国产琼脂条经过处理后的浊度分别为13.15NTU 和20.27NTU，参照日本对生化琼脂中浊度应小于20NTU 的标准，达到了生化琼脂浊度不高于20NTU 的标准。国产琼脂粉经过处理后的浊度为43.84NTU，达不到生化琼脂浊度不高于20NTU 的标准。该结果说明磷酸氢二钾化学沉淀法处理Sigma 琼脂和国产琼脂条，可以制备得到符合生化琼脂质量要求的琼脂产品。

图4 磷酸氢二钾处理对样液浊度及透明度的影响

2.5 消除琼脂磷酸盐沉淀的工艺设计及经济技术分析

通过以上研究结果，磷酸氢二钾处理Sigma琼脂和国产琼脂条，可以将琼脂的透明度提高至94%以上，将浊度降低至20NTU，符合生化琼脂的要求。在此基础上，根据相关文献[33]，以国产琼脂条为原料，对磷酸盐沉淀法去除琼脂磷酸盐沉淀进行工艺设计，评估其工艺的产业化经济可行性（图5）。磷酸盐沉淀法消除琼脂磷酸盐沉淀的工艺流程是：国产琼脂→溶胶→磷酸氢二钾预沉淀→过滤→凝胶→机械脱水→浸洗三次→机械脱水→干燥→粉碎。其中，溶胶是在蒸煮罐中加热使琼脂完全溶解，磷酸氢二钾预沉淀是溶胶后加入磷酸氢二钾形成沉淀，过滤是使用板框压滤机使生成的磷酸盐沉淀与胶液分离，机械脱水是通过压榨的方式使琼脂凝胶与磷酸盐水溶液分离，浸洗是使用纯水浸泡压榨后的琼脂凝胶使其中的磷酸盐溶出，多次浸洗再脱水尽可能去除琼脂凝胶中残留的磷酸盐，干燥是将压榨脱水后的琼脂凝胶于45～55℃烘干，粉碎是用粉碎机将干燥后的琼脂粉碎过80 目筛。假设在年产量1000t、每天生产三班、每班为8h制、每班需要1h设备清洗时间、设备不均匀系数取0.75、产品损耗率5%、年工作总天数300 天的条件下，如式(6)所示，班产量计算为1.11t。根据预实验结果，1t 国产琼脂条经过处理后可生产0.95t 消除磷酸盐沉淀的生化琼脂。根据阿里巴巴平台价格，国产琼脂条售价为13万元/吨，生化琼脂的市场售价为24 万元/吨。根据年产量1000t 生化琼脂的工艺设计，对生产车间投资总费用包括总设备投资及厂房建设投资进行核算（表1），总设备投资费用为53.48 万元，厂房建设投资费用为150 万元。设备按10 年折旧，余值5%计算设备折旧费为5.08 万元，对年生产成本包括水电汽消耗，原材料成本，易耗品成本及其他成本进行核算（表2），计算出年生产成本及年销售总额分别为14508.75 万元和24000 万元。根据年息税前利润[式(7)]及年利润[式(8)]计算投资利润率[式(9)]和静态投资回收期[式(10)]分别为64.01%和3.3年，该结果说明本研究消除琼脂磷酸盐沉淀的工艺具有经济可行性，产业化前景良好。

图5 消除磷酸盐沉淀的工艺流程（单位：mm）

表1 消除琼脂磷酸盐沉淀的车间建设总投资成本核算

表2 年产1000t消除磷酸盐沉淀的琼脂生产成本核算

3 结论

通过采用不同方法处理Sigma琼脂、国产琼脂粉及国产琼脂条，探索消除琼脂磷酸盐沉淀的方法。实验结果显示，加入磷酸氢二钾处理后Sigma琼脂和国产琼脂条，可以将琼脂的透明度提高至94%以上，将浊度降低至20NTU，符合生化琼脂的要求。工艺设计及经济成本核算表明，采用磷酸氢二钾法处理国产琼脂条消除磷酸盐沉淀，每处理1t国产琼脂条可增加收益约9.8 万元，总投资利润率为64.01%，静态投资回收期为3.3年。该研究建立的消除琼脂磷酸盐沉淀的工艺具有经济可行性，为国产化微生物培养基所用的生化琼脂的提供技术参考。