花椒籽粕蛋白质的酶提工艺研究

摘要：为高值化利用花椒加工业的副产物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）籽粕，采用酶解法对花椒籽粕蛋白质的提取进行了研究。考察了酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH值对花椒籽粕蛋白质回收率的影响。进一步通过正交试验确定了复合蛋白酶提取花椒籽粕蛋白质的优化工艺为酶添加量0.04%、酶解温度50℃、酶解时间6 h、pH值12.0，此时蛋白质回收率为（96.98±0.24）%。正交试验优化得到的工艺可有效提高花椒籽粕蛋白质的提取率，结果重复性好、稳定可行，可为今后合理利用该资源提供依据。

关键词：花椒籽粕蛋白质；酶解法；提取工艺

中图分类号：TS201.21 文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2025）01-0206-04

Study on Enzymatic Extraction Process of Zanthoxylum bungeanum Maxim. Seed Meal Protein

WANG Lu¹， CAI Lei¹， LIU Qi-hua²， CUI Chun^1*

（1.College of Food Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou 510641， China; 2.Anhui Yanzhifang Food Co.， Ltd.， Hefei 230001， China）

Abstract： In order to achieve high-value utilization of the by-product Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal in Zanthoxylum bungeanum Maxim. processing industry， the extraction of protein from Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal by enzymatic method is studied. The effects of enzyme addition amount， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis time， pH value on the recovery rate of Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal protein are investigated. Further， through orthogonal test， the optimal process for extracting protein from Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal by complex protease is determined as follows： the enzyme addition amount is 0.04%， the enzymatic hydrolysis temperature is 50℃， the enzymatic hydrolysis time is 6 h， and the pH value is 12.0， at this time， the protein recovery rate is （96.98±0.24）%. The process optimized by orthogonal test can effectively improve the extraction rate of Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal protein. The results have good repeatability， stability and feasibility， which can provide a basis for the rational utilization of Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal resource in the future.

Key words： Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal protein; enzymatic method; extraction process

收稿日期：2024-07-22

基金项目：广东省普通高校特色创新类项目（2021KTSCX003）

作者简介：王露（2000—），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技术。

花椒是我国重要的调味品、中药材和香料，目前人们主要食用从花椒果壳和花椒叶等部位所提取的花椒精油^[1-2]。花椒籽富含不饱和脂肪酸、蛋白质、膳食纤维、黑色素等物质，可进一步提取制备高价值产品^[3-7]。花椒籽粕是花椒生产中的主要副产物，脱脂后的花椒籽粕蛋白质含量达到70%，其蛋白质一级结构中富含呈味肽和活性肽序列，富含谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸^[8]，且具有价格低、产量大的特点，可作为一种优质、无毒的新型植物蛋白质资源。对花椒籽粕蛋白质进一步水解，可得到呈味肽、抗疲劳肽、降血压肽和抗氧化肽等功能性多肽，在食品添加剂和保健食品等领域具有广阔的开发利用前景^[9-10]。

目前国内已有多种提取花椒籽粕蛋白质的工艺。马寅斐等^[11]以脱油后的花椒渣料为原料，采用碱提酸沉工艺制得蛋白质含量为78.23%的花椒蛋白粉。吕俊霞^[12]以碱溶酸析法提取花椒籽蛋白质，提取率达33.40%。宋燕^[13]选用复合蛋白酶提取花椒籽蛋白质，得率为77.21%。姜欢笑等^[14]通过水相酶解法提取花椒冷榨饼中蛋白质，提取率为56.49%。李超^[15]采用盐提法提取花椒籽仁中蛋白质，提取率可达88.77%。然而，这些花椒籽粕蛋白质提取方法效率低，蛋白质回收率低，生产肽类产品成本高，因此，目前大部分花椒籽粕主要被用作饲料或肥料，既造成资源浪费，又导致环境污染，故深入研究花椒籽粕并使其得到合理充分的利用已成为我国花椒产业面临的一项新挑战。

本文采用酶法提取花椒籽粕中的蛋白质，以蛋白质回收率为指标，通过单因素试验确定提取花椒籽粕蛋白质的酶解条件，并通过正交试验优化提取工艺。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

花椒籽粕：陕西为康生物科技股份有限公司；复配蛋白酶胰酶1-12（4 000 U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；氢氧化钠：上海易恩化学技术有限公司。

1.2 主要仪器和设备

EXD-2202B电子天平 上海精密科学仪器有限公司；AL204电子分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；PHS-3E pH计 上海雷磁仪器厂；THZ-82恒温振荡器 常州国华电器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；HYP-308消化炉、KDN-103F凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质回收率的测定

称取适量花椒籽粕粉末或酶解液，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定花椒籽粕和酶解液的蛋白质含量，蛋白质回收率的计算公式如下：

蛋白质回收率（%）=酶解液总质量（g）×酶解液蛋白质含量（%）/所取花椒籽粕质量（g）×花椒籽粕蛋白质含量（%）×100%。

1.3.2 水解度的测定

采用甲醛滴定法^[16]测定酶解产物的水解度，计算公式如下：

水解度（%）=上清液中氨基酸态氮含量（%）/所取样品中总氮含量（%）×100%。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 酶添加量对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

准确称取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分别置于5个250 mL锥形瓶中，按酶解温度50℃、酶解时间6 h、料液比1∶8、酶添加量（以反应液总质量计）0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%进行酶解反应。反应结束后，沸水灭酶15 min，冷却后以10 000 r/min离心15 min，收集上清液后记录各样品上清液总重。分别取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，计算蛋白质含量和蛋白质回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，计算氨基酸态氮含量和水解度，确定最适酶添加量。

1.3.3.2 酶解温度对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

准确称取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分别置于5个250 mL锥形瓶中，按酶添加量0.08%（以反应液总重量计）、酶解时间6 h、料液比 1∶8、酶解温度45，50，55，60，65℃进行酶解。反应结束后，沸水灭酶15 min，冷却后离心（10 000 r/min，15 min），收集上清液后记录各样品上清液总重。分别取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，计算蛋白质含量和蛋白质回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，计算氨基酸态氮含量和水解度，确定最适酶解温度。

1.3.3.3 酶解时间对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

准确称取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分别置于5个250 mL锥形瓶中，按酶添加量0.08%（以反应液总质量计）、酶解温度50℃、料液比 1∶8、酶解时间 3，6，9，12，15 h进行酶解。反应结束后，沸水灭酶15 min，冷却后以10 000 r/min离心15 min，收集上清液后记录各样品上清液总重。分别取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，计算蛋白质含量和蛋白质回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，计算氨基酸态氮含量和水解度，确定最佳酶解时间。

1.3.3.4 pH值对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

准确称取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分别置于5个250 mL锥形瓶中，按酶添加量0.08%（以反应液总质量计）、酶解温度50℃、酶解时间6 h、料液比1∶8，用2 mol/L NaOH溶液调节反应液pH值为7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，稳定后进行酶解。反应结束后，沸水灭酶15 min，冷却后以10 000 r/min离心15 min，收集上清液后记录各样品上清液总重。分别取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，计算蛋白质含量和蛋白质回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，计算氨基酸态氮含量和水解度，确定最适pH值。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、pH值（D）作为变量，设计四因素三水平正交试验，以优化最佳的蛋白质提取工艺，因素水平见表1。

1.3.5 最佳工艺验证试验

准确称取3份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末，分别按照最佳酶解条件制备样品，并记录各样品上清液总重，分别取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，计算蛋白质含量和蛋白质回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，计算氨基酸态氮含量和水解度。

1.3.6 数据处理

每次试验重复3次，取平均值，以减小试验带来的偶然误差，采用SPSS 22.0、Origin 2019b等作图分析，以Tukey方法在95%置信区间进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 花椒籽粕蛋白质含量

重复3次试验，通过计算得到花椒籽粕的蛋白质含量为71.61%。

2.2 单因素试验

2.2.1 酶添加量对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

由图1可知，随着酶添加量的增加，蛋白质回收率和水解度均逐渐升高。当酶添加量为0.08%时，蛋白质回收率和水解度均达到最高，分别为47.32%和23.16%。虽然增加酶添加量可以使蛋白质回收率进一步升高，但考虑到实际生产成本，选择0.08%为最适酶添加量。

2.2.2 酶解温度对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

由图2可知，随着酶解温度的升高，蛋白质回收率先升高后降低，在50℃时达到最高，为46.89%，这可能是因为当温度继续升高时，酶活性受到抑制，使蛋白质回收率下降。在45，50，55 ℃的条件下，水解度没有显著性差异（P＜0.05）。因此，选择50℃为最佳酶解温度。

2.2.3 酶解时间对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长，蛋白质回收率呈现先升高后降低的趋势，当酶解时间达到6 h时，蛋白回收率达到最大值46.89%。随着酶解时间的延长，水解度逐渐升高，这是由于蛋白质被进一步水解成氨基酸和肽，因此，选择6 h为最佳酶解时间。

2.2.4 pH值对花椒籽粕蛋白质回收率和水解度的影响

由图4可知，随着pH值的增大，蛋白质回收率呈上升趋势，在pH值12.0时达到最高90.27%。当pH值继续增大时，虽然蛋白质回收率有进一步提升的空间，但蛋白酶会失去活性，大大降低水解度，过高的pH值不仅不适用于工业生产，而且会降低蛋白质的营养价值并产生有害物质。因此，选择pH值12.0作为较优pH值条件。

2.3 正交试验结果

结合单因素试验所得结果，设计四因素三水平正交试验对花椒籽粕蛋白质的酶解条件进行优化，以便使蛋白质提取率得到进一步提高。正交试验结果极差分析见表2。

由表2可知，各因素对蛋白质回收率影响的主次顺序为D＞B＞A＞C，即pH值的影响最大，其次是酶解温度和酶添加量，酶解时间的影响最小。最优方案为A₁B₂C₂D₃，即酶解条件为酶添加量0.04%、酶解温度50℃、酶解时间6 h、pH值12.0。

直观分析法无法判断是试验误差还是各因素导致的结果差异，同时也不能通过直观分析法判断因素的变化影响是否显著。因此，有必要进一步做正交试验结果的方差分析，见表3。

由表3可知，各因素对蛋白质回收率的影响顺序为pH值＞酶解温度＞酶添加量＞酶解时间。由P值可知，以蛋白质回收率为考察指标时，试验各因素的P值均小于0.01，说明各因素都对试验结果有极显著影响。因此，应选择各因素中水平最高的，即最优方案为A₁B₂C₂D₃，与极差分析结果一致。

2.4 最佳提取工艺验证试验

由于正交试验结果极差分析和方差分析所得的最优方案不包含在9个已做试验中，因此对A₁B₂C₂D₃的试验方案进行重复试验验证，结果见表4。

由表4可知，该方案的蛋白质回收率均达到96%以上，高于正交试验的最高水平，故最佳工艺验证试验成功，说明该提取工艺具有较好的稳定性。因此，确定以A₁B₂C₂D₃，即酶添加量0.04%、酶解温度50℃、酶解时间6 h、pH值12.0为最佳工艺条件，此时蛋白质回收率为（96.98±0.24）%，蛋白质含量为（8.10±0.00）%，水解度为（3.80±0.06）%。

3 结论

本文通过单因素试验和正交试验确定了复合蛋白酶提取花椒籽粕蛋白质的最优条件为酶添加量0.04%、酶解温度50℃、酶解时间6 h、pH值12.0，此时蛋白质回收率为（96.98±0.24）%。本工艺可为花椒籽粕的综合利用提供重要参考，证明花椒籽粕具有良好的开发价值，应综合利用并加强资源开发力度。

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