在线凝胶渗透色谱-气质联用法测定腌制鱼中7种N-亚硝胺类化合物的一测多评研究
2025-01-26雷军胡悦
摘要：目的：建立气质联用法结合QuEChERS法和在线凝胶渗透色谱技术检测腌制鱼中7种N-亚硝胺类化合物，并对采用的一测多评法进行研究。方法：样品经优化后的QuEChERS法提取和净化后，采用在线凝胶渗透色谱技术进行二次净化。试验对QuEChERS方法进行了优化，对基质效应、样品溶液的稳定性和方法耐受性进行了试验，并进行了方法学验证；试验以NDMA为参照对象，建立了其余6种N-亚硝胺类化合物一测多评校正方法。结果：经凝胶渗透色谱技术净化后，可有效除去大部分杂质，降低基质效应，提高灵敏度。校正因子分别为ƒNMEA/NDMA=6.736 9、ƒNDEA/NDMA=0.667 9、ƒNDPA/NDMA =0.239 9、ƒNDBA/NDMA=1.153 2、ƒNPIP/NDMA=0.728 9、ƒNPYR/NDMA=0.710 3，且稳定性较好。方法学验证表明，7种N-亚硝胺类化合物的检出限为0.02～0.29μg/kg；加标回收率和精密度分别为NDMA 101.0%～107.5%，2.5%～3.9%；NMEA 102.0%～108.4%，2.8%～4.0%；NDEA 101.6%～109.0%，2.6%～3.9%；NDPA 103.1%～107.4%，1.9%～4.0%；NDBA 103.7%～107.7%，1.7%～3.8%；NPIP 104.7%～107.5%，2.3%～3.7%；NPYR 101.4%～106.4%，2.2%～3.8%。结论：该方法具有灵敏度高、操作简便、方法稳定等特点，适用于大批量腌制鱼中N-亚硝胺类化合物的测定。
关键词：一测多评；N-亚硝胺类化合物；在线凝胶渗透色谱；气质联用
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2025）01-0201-05
QAMS Study on Determination of Seven N-Nitrosamines in Pickled Fish by Online Gel Permeation Chromatography-Gas
Chromatography-Mass Spectrometry
LEI Jun1，HU Yue2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Mianyang Teachers' College， Mianyang 621000， China; 2.College of New Energy Materials and Chemistry， Leshan Normal University， Leshan 614000， China）
Abstract： Objective： GC-MS combined with QuEChERS method and online gel permeation chromatography is established to detect seven N-nitrosamines in pickled fish， and the QAMS method used is studied. Methods： After the sample is extracted and purified by the optimized QuEChERS method， it is purified by online gel permeation chromatography for the second time. The QuEChERS method is optimized， the matrix effect， the stability of sample solution and the tolerance of the method are tested， and the methodology validation is conducted. Taking NDMA as the reference object， the QAMS calibration method for the determination of other six N-nitrosamines is established. Results： After purification by online gel permeation chromatography， most impurities are effectively removed， the matrix effect is reduced， and the sensitivity is improved. The correction factors are ƒNMEA/NDMA=6.736 9， ƒNDEA/NDMA=0.667 9， ƒNDPA/NDMA=0.239 9， ƒNDBA/NDMA=1.153 2， ƒNPIP/NDMA=0.728 9 and ƒNPYR/NDMA=0.710 3 respectively， and the stability is good. Methodology validation shows that the detection limits of seven N-nitrosamines range from 0.02μg/kg to 0.29μg/kg. The spiked recovery rates and precisions are NDMA 101.0%～107.5%， 2.5%～3.9%; NMEA 102.0%～108.4%， 2.8%～4.0%; NDEA 101.6%～109.0%， 2.6%～3.9%; NDPA 103.1%～107.4%， 1.9%～4.0%; NDBA 103.7%～107.7%， 1.7%～3.8%; NPIP 104.7%～107.5%， 2.3%～3.7%; NPYR 101.4%～106.4%， 2.2%～3.8% respectively. Conclusion： The method has the characteristics of high sensitivity， simple operation and stability， and is suitable for the determination of N-nitrosamines in large quantities of pickled fish.
Key words： QAMS; N-nitrosamines; online gel permeation chromatography; GC-MS
收稿日期：2024-07-11
基金项目：四川省科技厅重点项目（2018JY0065）
作者简介：雷军（1975—），男，副教授，博士，研究方向：天然药物的化学成分。
N-亚硝胺类化合物是由食品在生产过程中产生的胺类物质与硝酸盐或亚硝酸盐发生化学反应生成的。N-亚硝胺类化合物是一类国际公认的较强致癌物，长期低剂量接触及一次性大剂量接触均可显著增加致癌的可能性[1]。随着研究的深入，亚硝胺已经被证实具有很强的生物毒性[2]。腌制鱼因风味鲜美而受到人们的喜爱，但在腌制过程中，鱼体内蛋白质分解成的胺类物质与产生的亚硝酸盐在一定条件下会生成N-亚硝胺类化合物。
目前，食品中N-亚硝胺类化合物的检测方法主要有GC法[3]、GC-MS/MS法[4]和LC-MS/MS法[5]。N-亚硝胺类化合物在食品中的含量一般较低，传统的GC法较难满足要求；LC-MS/MS法需要使用APCI离子源；具有灵敏度高、稳定性好、定性能力强的GC-MS/MS法是N-亚硝胺类化合物理想的检测方法。在前处理方面，国标GB 5009.26—2016[6]中的前处理方法过程较繁杂，试剂消耗量大，污染环境，整个试验耗时较长，不适合大批量样品同时检测；国标GB 5009.26—2023也有内标物较贵等缺点。QuEChERS法是集提取、净化为一体的前处理方法，具有操作简单、试剂用量小等特点，特别适合大批量样品的同时检测。童学智等[7]利用QuEChERS法快速测定水产品中5种HBQs。管悦等[8]利用QuEChERS法同时检测酱腌菜中11种N-亚硝胺类化合物。在线凝胶渗透色谱技术主要对初步净化后的样品进行二次净化，可进一步除去样品中的杂质，与传统的离线凝胶渗透色谱技术相比，具有回收率显著提高、试剂使用量显著降低的特点。倪海平等[9]利用在线凝胶渗透色谱技术测定植物油中11种有机磷阻燃剂。李洁等[10]利用在线凝胶渗透色谱技术实现了动物源性食品中多种农药残留的筛查。
一测多评法是采用单个易获得的对照品、实现多个组分同时测定的方法[11]，解决了药品质量管理中对照品不易得或者易分解等问题[12-13]。近年来，这种方法逐渐应用于食品检测方面[14-15]。试验采用QuEChERS法提取和初步净化，利用在线凝胶渗透色谱技术二次净化后，采用一测多评法测定腌制鱼中7种N-亚硝胺类化合物的含量。一测多评法可有效减少试验人员与N-亚硝胺类化合物的接触，降低其对试验员可能产生的身体损害。该方法操作简便、方法稳定，尤其适用于大批量样品中N-亚硝胺类化合物的测定。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氨水、无水硫酸镁、无水乙酸钠（均为分析纯）、乙腈（色谱纯，诺尔施）：成都市科隆化学品有限公司；C18、PSA、硅胶和GCB：纳谱分析技术（苏州）有限公司；N-亚硝胺类化合物标准溶液（Lot：LRAC5073）：美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 主要仪器
GC-MS/MS-TQ8040型气相色谱-质谱/质谱仪、LC-20A凝胶渗透色谱（GPC）仪 日本岛津公司；ME204T/02型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TGL-20B-C型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；KQ-800B型超声波清洗机 昆山舒美超声仪器有限公司；VORTEX MS3型多功能漩涡混合器 莱普特科学仪器（北京）有限公司。
1.3 检测条件
进样口温度：230℃，不分流（PTV进样）；毛细管柱：InertCap FFAP（30 m×0.32 mm×0.25μm）；柱温采用梯度升温，起始温度50℃，保持4 min，以5℃/min升温至140℃，再以20℃/min升温至230℃；线速度：64.7 cm/s；载气：高纯氦气，纯度大于99.999%；溶剂延迟：4 min；EI源，温度200℃；MS接口温度250℃；PTV进样口升温程序：初始温度120℃，保持5 min，然后以100℃/min升温至230℃，保持20 min；进样口升压程序：初始压力67.1 kPa，以100 kPa/min 升压至180 kPa，保持5 min，然后以49.8 kPa/min降压至67.1 kPa，保持20 min；隔垫吹扫程序：初始流量5.0 mL/min，进样采集后以10 mL/min的速度降至0 mL/min，保持6 min，然后以10 mL/min的速度升至5 mL/min，保持15 min；GPC 条件：色谱柱：Shodex CLNpak EV-200（2.1 mm×150 mm）；流动相：丙酮与环己烷体积比为3∶7；流速：0.1 mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。在线凝胶渗透色谱时间程序见表1，7种N-亚硝胺类化合物质谱条件和保留时间见表2。
1.4 标准溶液
1.4.1 N-亚硝胺类化合物储备液
精密移取5.0μL N-亚硝胺类标准溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成N-亚硝胺类化合物储备液，浓度为1.0μg/mL。
1.4.2 N-亚硝胺类化合物中间溶液
精密移取1.0 mL N-亚硝胺类标准储备液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成N-亚硝胺类化合物储备液，浓度为100 ng/mL。
1.5 样品前处理
称取均质后的腌制鱼试样5.0 g置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 1%氨水溶液和10 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取10 min，中间手动振摇1次，加入5颗玻璃珠均质子，加入6 g MgSO4和1.5 g NaAc，涡旋混合1 min，以10 000 r/min离心5 min，吸取2 mL上层溶液至事先称好的含150 mg MgSO4、50 mg C18、50 mg PSA和30 mg GCB的5 mL塑料离心管中，涡旋振荡1 min，以8 000 r/min离心5 min，准确移取上清液1 mL用40℃氮吹仪吹干，加入1 mL二氯甲烷，涡旋振荡30 s，过有机相滤膜，待上机测定。
2 结果与分析
2.1 QuEChERS法的优化
QuEChERS法常用的净化试剂包括PSA、C18、GCB。PSA可除去样品中的有机酸、脂肪酸、糖类等物质；C18对蛋白质、色素有一定的吸附作用；GCB可除去大部分色素和甾醇[16]。取不含N-亚硝胺类化合物的试样，按照2μg/kg的水平加入一定量的7种N-亚硝胺类化合物，以加标回收率为指标，分别考察C18、PSA、GCB的添加量。当C18、PSA添加量均控制在50 mg时，GCB的添加量分别为0，10，30，50，70，90 mg。试验发现，随着GCB添加量的增加，净化后的颜色逐渐变浅；当GCB添加量为30 mg时，7种N-亚硝胺类化合物的回收率为105.4%～112.9%，随着GCB添加量的进一步增加，N-亚硝胺类化合物的回收率未见明显变化，综上，GCB添加量为30 mg；依照此方法对PSA和C18添加量进行优化，结果表明C18、PSA的添加量均为50 mg时净化效果最好。
2.2 在线凝胶渗透色谱技术的净化效果
分别称取2份均质后的腌制鱼试样，按照“1.5”步骤提取和净化，一份净化后直接进GC-MS/MS，另一份净化后进在线凝胶渗透色谱后进GC-MS/MS，结果见图1～图2。
由图1和图2可知，经在线凝胶渗透色谱技术净化后的样品中杂质较未经在线凝胶渗透色谱技术净化的样品显著降低，基线下降且平滑，不仅会降低试样的基质效应，降低背景干扰，而且会提高方法的灵敏度。因此，试验采用在线凝胶渗透色谱技术对样品进行二次净化。
2.3 基质效应（ME）
基质效应（ME）是样品进入离子源时，干扰物和目标物竞争离子化，导致目标物的响应值增强或减弱。试验采用标准曲线法[17]，即基质效应=基质匹配溶液斜率/溶剂标准溶液斜率×100%。当85%lt;｜ME｜lt;115%时可忽略基质效应的存在，仅用空白溶液配标即可。否则不可忽略基质效应，即需采用内标法消除基质效应。7种N-亚硝胺类化合物的基质效应见表3。7种N-亚硝胺类化合物的基质效应均在85%～11.5%之间，可忽略基质效应的存在，可能的原因是试验采用在线凝胶渗透色谱技术，进一步提升了样品的净化效果，降低了基质效应。因此，试验不需采用内标法，仅需采用空白基质溶液配标的方法进行校准。
2.4 线性方程、检出限及定量限
分别吸取不同体积的N-亚硝胺类中间标准溶液，用空白溶液定容至1 mL。配制成浓度分别为0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0 ng/mL的标准系列，以浓度为横坐标、相应峰面积为纵坐标绘制线性方程。以各物质的定量离子信噪比的3倍（S/N=3）计算方法的检出限，以信噪比的10倍（S/N=10）计算方法的定量限，结果见表3，相应的总离子流图见图3。
2.5 方法的准确度和精密度
称取9份不含N-亚硝胺类化合物的试样各5 g，每3份为一组，按照水平为1.0，2.0，10.0μg/kg添加7种N-亚硝胺类化合物，按照“1.5”进行前处理，上机。将计算结果与添加浓度进行比较，以加标回收率表征方法的准确度；以每组水平的3个平行计算RSD值，以不同浓度的RSD值表征精密度。
由表4可知，7种N-亚硝胺类化合物在添加水平为1.0，2.0，10.0μg/kg时，加标回收率范围为101.0%～109.0%，说明方法的准确性较好；RSD值为1.7%～4.0%，说明方法的精密度较好。综上，该方法准确、精密度高，可用于腌制鱼中7种N-亚硝胺类化合物的测定。
2.6 样品溶液稳定性及方法耐受性试验
取不含N-亚硝胺类化合物的腌制鱼样品，按加标浓度为2.0μg/kg制得质控样，按“1.5”制得样品溶液，将样品溶液在0，8，16，24，32，40，48 h进样，测得峰面积，计算不同时间进样峰面积，RSD值表征样品溶液的稳定性，结果显示，RSD值为3.7%。请5位试验员用该方法处理浓度为2.0μg/kg的样品，做人员比对试验，测得5位试验员试验的峰面积，以RSD值表示，结果显示RSD值为3.2%；第1，2，3，4，5天分别用该方法处理浓度为2.0μg/kg的样品，做日间稳定性试验，以RSD值表示，结果显示RSD值为2.1%。以人员比对试验和日间稳定性试验共同表征方法的耐受性。综上，该方法测得的样品溶液在2 d内稳定；方法的耐受性较强。
2.7 校正因子ƒ值和相对保留时间t值
试验采用最先出峰且峰形较好的NDMA为研究对象，以其余6种N-亚硝胺类化合物标准曲线的斜率分别与NDMA的斜率的比值作为校正因子ƒ，同时，以NDMA的截距作为其余6种N-亚硝胺类化合物校正方程的截距拟合校正方程；同理，以NDMA的保留时间作为参照，以其余6种N-亚硝胺类化合物的保留时间与NDMA的保留时间的比值作为相对保留时间t。由表3可知，校正因子ƒNMEA/NDMA=557 395/82 737=6.736 9，ƒNDEA/NDMA=55 258/82 737=0.667 9，ƒNDPA/NDMA=22 329/82 737=0.239 9，ƒNDBA/NDMA=95 412/82 737=1.153 2，ƒNPIP/NDMA=60 305/82 737=0.728 9，ƒNPYR/NDMA=58 768/82 737=0.710 3。NMEA校正方程为y=82 737ƒNMEA/NDMA +1 902.3；NDEA校正方程为y=82 737ƒNDEA/NDMA+1 902.3；NDPA校正方程为y=82 737ƒNDPA/NDMA+1 902.3；NDBA校正方程为y=82 737ƒNDBA/NDMA +1 902.3；NPIP校正方程为y=82 737ƒNPIP/NDMA+1 902.3；NPYR校正方程为y=82 737ƒNPYR/NDMA +1 902.3；6种N-亚硝胺类化合物相对保留时间为tNMEA/NDMA=1.143 5，tNDEA/NDMA =1.221 9，tNDPA/NDMA=1.636 5，tNDBA/NDMA=2.147 5，tNPIP/NDMA =2.175 5，tNPYR/NDMA=2.281 5。
2.8 校正因子ƒ值耐受性
校正方程中最重要的因素是校正因子，因此保证校正因子在不同影响因素下具有足够的耐受性是非常重要的，在实际过程中考察了进样量、线速度、色谱柱、进样口温度等可能影响校正因子的因素，结果见表5。
由表5可知，考察的4个可能影响校正因子的因素影响均较小。进样量变化时，6个校正因子（ƒNMEA/NDMA、ƒNDEA/NDMA、ƒNDPA/NDMA、ƒNDBA/NDMA、ƒNPIP/NDMA、ƒNPYR/NDMA）的RSD值依次为0.025%、0.13%、0.50%、0.16%、0.15%、0.27%；线速度变化时，6个校正因子（ƒNMEA/NDMA、ƒNDEA/NDMA、ƒNDPA/NDMA、ƒNDBA/NDMA、ƒNPIP/NDMA、ƒNPYR/NDMA）的RSD值依次为0.016%、0.19%、0.63%、0.11%、0.13%、0.29%；色谱柱变化时，6个校正因子（ƒNMEA/NDMA、ƒNDEA/NDMA、ƒNDPA/NDMA、ƒNDBA/NDMA、ƒNPIP/NDMA、ƒNPYR/NDMA）的RSD值依次为0.018%、0.18%、0.50%、0.10%、0.14%、0.20%；进样口温度变化时，6个校正因子（ƒNMEA/NDMA、ƒNDEA/NDMA、ƒNDPA/NDMA、ƒNDBA/NDMA、ƒNPIP/NDMA、ƒNPYR/NDMA）的RSD值依次为0.014%、0.14%、0.36%、0.12%、0.15%、0.16%。
3 实际样品的测定
从贵阳市面上随机抽取10批散装腌制鱼，按上述方法检测7种N-亚硝胺类化合物，结果见表6。
由表6可知，市场上随机抽取的10个批次的散装腌制鱼样品中部分检出7种N-亚硝胺类化合物的1种或2种，表明在现有的腌制技术下，N-亚硝胺类化合物仍然是存在于一定比例的腌制鱼中，虽然未超过国家规定的限量标准[18]，但是长期食用也能显著增加患癌的可能性。
4 结论
试验采用优化后的QuEChERS法检测腌制鱼中7种N-亚硝胺类化合物。与传统的水蒸气蒸馏法前处理相比，具有方法稳定、操作简单、试剂用量小等优点，特别适合大批量样品同时检测。采用在线凝胶渗透色谱技术进行二次净化，有效去除了干扰成分，提高了方法的灵敏度，显著降低了基质效应，试验不需采用内标法，仅需采用空白基质溶液配标的方法进行校准。试验进行了样品的稳定性和方法耐受性试验，在此基础上进行了一测多评研究。研究表明，样品的稳定性和方法耐受性较好，方法校正因子耐受性较好，能够满足要求；试验从线性范围、检出限、加标回收率、精密度等方面进行了方法学验证。结果表明，该方法具有操作简便、灵敏度高、稳定性好等优点，适合腌制鱼中7种N-亚硝胺类化合物的检测。
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