齿瓣石斛多糖提取工艺研究

陈玲玲++王洪云++杨发建++李铭

【摘要】目的：通过正交实验对齿瓣石斛多糖的提取工艺进行优化研究。方法：采用苯酚-硫酸法考察提取容积、提取时间、提取次数、提取温度等因素时多糖提取的影响，通过正交试验找出最佳提取工艺。结果：多糖提取的最佳条件，提取温度95℃、提取时间1h、提取次数2次、料液比1∶[KG-*3/5]25。结论：该工艺简单合理，多糖提取率高。

【关键词】齿瓣石斛；多糖；提取工艺；正交实验

【中图分类号】R917【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）01-0026-03

Research on the Crafts of Extracting Polysaccharide from Dendrobium

CHEN LinglingWANG HongyunYANG FajiangLI Ming*

Baoshan College of Traditionnal Chinese Medicine Department of TCM，Baoshan 678000，China

Abstract：Objective The author carried out optimization study of the crafts of extracting polysaccharide from dendrobium devonianum through orthogonal tests. Methods The author used phenol - sulfuric acid method to study the extraction volume， extraction period， extraction times， extraction temperature and other factors affect the polysaccharide extracted， and find the best extraction process by orthogonal test. Results The optimum conditions of polysaccharide extraction is that：temperature of 95℃， extraction time 1h， extraction times 2 times， solid-liquid ratio 1∶[KG-*3/5]25. Conclusion The process is simple，reasonable，with high rates of extraction of polysaccharide.

Keywords：Dendrobium Devonianum； Polysaccharide； Extraction Process； Orthogonal Experiment

[JP2]齿瓣石斛（Derdrobium devoninum Paxt.）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium） 亚热带附生型多年生草本植物，俗称黄草。在云南共有石斛品种46种，保山市龙陵县境内就有40余种[1]，龙陵县是最早实现齿瓣石斛产业化栽培的地区，占全国齿瓣石斛栽培面积的70%以上[2]。现代研究显示，石解具有免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]及保肝护肝的功效，具有非常高的药用价值，可用于多种疾病的防治。齿瓣石斛的主要有效物质是石斛多糖，但目前对齿瓣石斛的多糖提取工艺研究较少，而水提法在石斛多糖提取的应用非常广泛，本文采用水提法[7]，并且通过正交试验对齿瓣石斛多糖的提取工艺进行优化研究，为开发齿瓣石斛提供技术支撑，对云南保山龙陵齿瓣石斛产业的发展具有十分重要的意义。

1仪器与材料

1.1仪器UV2401PC紫外可见分光光度计（日本岛津）；PL-203电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-250B超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；FZ102微型植物试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；XMTD-4000电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；101-1A电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）；TDZ5-WS湘式离心机（长沙高新技术产业开发区湘式离心机仪器有限公司）。

1.2材料无水葡萄糖（批号：20120417，国药集团化学试剂有限公司）；苯酚（批号：20071228，天津市化学试剂三厂）；盐酸氨基葡萄糖（批号：A308522，北京伊诺凯科技有限公司）；无水乙醇（批号：20111201，重庆川东化工集团有限公司）。齿瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt.） 鲜品，洗净，60℃烘干，粉碎过60目筛，置干燥器中，备用。

2方法

2.1多糖的含量测定方法按2010版《中华人民共和国药典》[8]一部铁皮石斛多糖含量测定方法测定齿瓣石斛多糖含量。

2.1.1苯酚显色溶液的配制取苯酚100g，加铝粉0.1g和碳酸氢钠0.05g，常压蒸馏，收集182℃馏分。称取该馏分5g，置100mL容量瓶中，加新鲜蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，滤过至棕色试剂瓶中，得5%苯酚溶液（临用配制）。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品12.35mg，置100mL容量瓶中加适量蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每1mL含葡萄糖0.1235mg）。

2.1.3供试品溶液的制备取样品粉末约0.3g，精密称定，加水200mL，加热回流2h，放冷，轉移至250mL容量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液4mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心（转速为每分钟4000转）20min，弃去上清液（必要时滤过），沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。测定方法：精密量取供试品溶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自精密加入5%苯酚溶液1mL起，依法测定吸光度，按线性回归方程计算多糖含量。

2.2标准曲线的制备分别吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至10mL具塞试管中，各以蒸馏水补至1.0mL，然后加入5%苯酚溶液1mL及5mL浓硫酸，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出后在自来水中迅速冷却至室温，然后以蒸馏水为空白，紫外分光光度法在488nm的波长处测定吸光度，

2.3齿瓣石斛多糖提取的单因素考察

2.3.1提取溶剂水料液比对多糖含量的影响测定方法照供试品溶液制备项方法测定，固定其他因素，其中料液比为1∶[KG-*3/5]20 ，按试验设计设置为4个水平，即分别为加水100、150、200、250mL试验。

2.3.2样品提取时间测定方法照供试品溶液制备项方法测定，固定其他因素，其中加热回流2h，按试验设计设置为4个水平，即分别为加热回流1、2、3、4h试验。

2.3.3提取次数测定方法照供试品溶液制备项方法测定，固定其他因素，其中加热回流2h，按试验设计设置为4个水平，即分别为加热回流1次、2次、3次、4次试验。

2.3.4浸提提取温度测定方法照供试品溶液制备项方法测定，固定其他因素，其中加热浸提2h，按试验设计设置为4个水平，即分别为加热温度70℃、80℃、90℃、95℃试验。

2.4正交试验设计为了优化工艺，根据以上实验结果，以提取温度、提取时间、提取次数、料液比为实验因素，设计L9（3）4正交试验。正交设计见表1。

3结果

3.1标准曲线的绘制紫外分光光度法在488nm的波长处测定不同浓度的吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：Y = 0.0701X+0.0073，R=0.9998 （n=6）。结果见表2、图1。

3.2多糖的含量测定结果由表3～6可知，用量水大，多糖的含量高；提取时间短多糖含量高；提取次数为2次多糖含量高；提取温度越高多糖含量高。

3.3正交试验设计结果齿瓣石斛提取正交试验因素水平及结果见表7。按照正交结果进行验证试验，齿瓣石斛多糖得率为 36.14%，RSD= 2.61%（n=3）。结果表明该工艺稳定。

3.4多糖提取工艺优化后的验证按照上述优化条件，用20.5kg 新鲜齿瓣石斛进行放大试验。鲜齿瓣石斛（20.5kg），晒干，得干品3.8kg，粉碎。料液比为1 ∶[KG-*2]25，加热回流2次，每次回流1h，放冷，减压浓缩至50L，加入4倍量无水乙醇，冷藏沉淀粗多糖，冷冻干燥得粗多糖1014.6g，即多糖含量为26.7%。

4讨论

根据多糖性能，选用水煎煮工艺法，依据2010版药典中供试品溶液制备方法，可发现多糖提取过程中有4个因素对多糖含量的影响较大，故而本次齿瓣石斛多糖提取工艺优化试验设计了4个因素4个水平的优化试验。从单因素试验结果发现：随着提取溶剂料液比的增大而增加，多糖提取率呈现出递增的现象，在料液比1∶[KG-*3/5]25的时候多糖含量最高；提取时间的长短对多糖提取率的影响则呈现递减的现象，在2h以后，多糖含量呈递减的现象；随着提取次数的增加，多糖的含量增加，但提取次数大于2次以后，多糖的含量增加不明显，可能原材料中的多糖接近全部溶出，说明提取次数对于多糖的含量有影响；在不同温度下提取多糖，70℃、80℃、90℃、95℃的条件下提取多糖，结果分别为28.3%、28.7%、29.5%、32.3%，随着温度的升高多糖的含量有所升高在100℃达到最高状态。

由正交试验极差分析可知，提取温度、提取次数、提取料液比及提取时间均对提取多糖的含量有显著的影响，其因素主次顺序为 A> C> D > B，即最重要的因素为提取温度，其次是提取次数，再次是提取料液比，最后是提取时间。最佳组合为A3B1C2D3，可以确定齿瓣石斛多糖提取在料液比1∶[KG-*2]25，加热回流1h，提取次数2次，提取温度100℃条件下最优。该工艺稳定可行，可用于齿瓣石斛多糖的提取。齿瓣石斛为保山龙陵的珍贵药物资源，對齿瓣石斛多糖提取工艺的优化研究，有利于提高其利用率，为开发齿瓣石斛提供技术支撑。

参考文献

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[2] 明兴加，刘家保，钟国跃，等. 珍稀齿瓣石斛的生物学特性及其野生资源保护[J]. 中国野生植物资源，2012，11（25） ： 511-513.

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[7]钱叶，吕不望.石斛中石斛多糖的提取工艺研究[J].中国现代应用药学，2005，22（4）：293-294.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录IVA23-24.

（编辑：穆丽华）