不同危重程度社区获得性肺炎患儿肺部微生物特征分析

[摘要]"目的"研究不同危重程度社区获得性肺炎（community-acquired"pneumonia，CAP）患儿肺部微生物组学的特征，从而为肺炎患儿的精准诊断及抗生素治疗提供依据，并且为肺部微生态在肺炎患儿的诊断与治疗中的作用提供新策略和新视野。方法"收集2023年1月至12月在荆门市人民医院儿科住院的64例不同危重程度CAP患儿的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar"lavage"fluid，BALF），将患儿分为重症肺炎组（n=34）和普通肺炎组（n=30）。通过BALF的宏基因组测序获得不同危重程度CAP患儿肺部的微生物组学信息，对得出的两组样本的菌群生物信息数据进行菌群结构多样性分析、物种分类分析及差异性分析。结果"Alpha多样性分析显示，两组患儿BALF的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数比较，差异均有统计学意义（Plt;0.05）。Beta多样性的主坐标分析（principal"coordinate"analysis，PCoA）显示，两组患儿BALF的微生态菌群组成相异性比较，差异有统计学意义（F=4.221，P=0.005）。经物种分类分析发现，在属水平，重症肺炎组患儿BALF样本中以支原体属为主，其次为链球菌属，第三为嗜血杆菌属，普通肺炎组患儿BALF样本中以链球菌属为主，其次为支原体属，第三为嗜血杆菌属。两组患儿的微生物种群在属水平层面排名前20位物种中丰度差异有统计学意义（Plt;0.05）的是支原体属、链球菌属、红球菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属。物种差异性分析显示，在属水平，有47个物种有差异（Plt;0.05）。结论"不同危重程度CAP患儿的肺部微生物菌群丰度、多样性及微生物组结构与组成存在差异性，不同危重程度CAP患儿间优势菌群有所不同，本研究丰富了CAP患儿的肺部微生物组学数据。

[关键词]"支气管肺泡灌洗液；宏基因组测序；社区获得性肺炎；肺部微生态

[中图分类号]"R725.6""""""[文献标识码]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.36.005

Microbial"characteristics"analysis"of"the"lungs"in"children"with"community-acquired"pneumonia"of"different"severity"levels

WU"Yong，"PAN"Xiuxia，"QIN"Hua，"LIU"Yunjun，"ZHU"Yan，"WANG"Sijia，"LIANG"Yonghua，"ZENG"Rong，"WU"Qian

Department"of"Pediatrics，"Jingmen"People’s"Hospital，"Jingmen"448000，"Hubei，"China

[Abstract]"Objective"To"study"microbial"characteristics"of"pulmonary"in"children"with"community-acquired"pneumonia"（CAP）"of"different"severity，"in"order"to"provide"a"basis"for"accurate"diagnosis"and"antibiotic"treatment"of"pneumonia"children，"and"provide"new"strategies"and"perspectives"for"the"diagnosis"and"treatment"of"pulmonary"microbiota"in"pneumonia"children."Methods"Bronchoalveolar"lavage"fluid"（BALF）"from"64"children"with"CAP"of"different"severity"hospitalized"in"Department"of"Pediatrics，"Jingmen"People’s"Hospital"were"collected"from"January"to"December"2023，"the"children"were"divided"into"severe"pneumonia"group"（n=34）"and"common"pneumonia"group"（n=30）."Microbiome"information"of"the"lungs"of"children"with"CAP"of"different"severity"were"obtained"through"metagenomic"sequencing"of"BALF，"microbial"structure"diversity"analysis，"species"classification"analysis，"and"differential"analysis"on"the"microbial"bioinformatics"data"of"two"groups"of"samples"obtained"were"performed."Results"Alpha"diversity"analysis"showed"that"there"were"statistically"significant"differences"（Plt;0.05）"in"the"Chao1"index，"ACE"index，"Shannon"index，"and"Simpson"index"between"two"groups."The"principal"coordinate"analysis"（PCoA）"of"Beta"diversity"showed"a"statistically"significant"difference"in"the"composition"of"microbial"communities"between"two"groups"（F=4.221，"P=0.005）."Through"species"classification"analysis，"it"was"found"that"at"the"genus"level，"mycoplasma"was"the"main"genus"in"the"BALF"samples"of"severe"pneumonia"group，"followed"by"Streptococcus"and"Haemophilus，"Streptococcus"was"the"main"genus"in"the"BALF"samples"of"common"pneumonia"group，"followed"by"Mycoplasma"and"Haemophilus."Children"of"two"groups"showed"statistically"significant"differences"in"microbial"abundance"among"the"top"20"species"at"the"genus"level"（Plt;0.05），"including"Mycoplasma，"Streptococcus，"Rhodococcus，"Neisseria，"Prevotella，"Corynebacterium，"and"Pseudomonas."Species"diversity"analysis"showed"that"at"the"genus"level，"there"were"47"species"with"differences"（Plt;0.05）."Conclusion"There"are"differences"in"the"abundance，"diversity，"structure，"and"composition"of"pulmonary"microbiota"in"children"with"CAP"of"different"severity."The"dominant"microbiota"varies"among"children"with"CAP"of"different"severity."This"study"enriches"the"pulmonary"microbiome"data"of"children"with"CAP.

[Key"words]"Bronchoalveolar"lavage"fluid;"Metagenomic"sequencing;"Community"acquired"pneumonia;"Pulmonary"microbiome

世界卫生组织资料显示，2016年肺炎造成92万5岁以下儿童死亡，其中98%来自发展中国家；肺炎也是当前中国5岁以下儿童死亡的主要原因之一，其中绝大部分儿童肺炎为社区获得性肺炎（community-"acquired"pneumonia，CAP）[1]。通过支气管肺泡灌洗获取的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar"lavage"fluid，BALF）有“液体肺活检”之称[2]。基于BALF的高通量测序研究可全面准确地反映肺部微生物群情况，对肺部感染的诊断具有重要意义[3-4]。随着肺部微生物组学（又称肺部微生态）测序技术的发展，曾被认为是无菌的肺部已被证实微生物共生体的存在，并可测得组成和相对丰度[5-6]。肺部微生物组的多样性及稳定性对抵抗病原体定植，参与机体新陈代谢和免疫功能发育有巨大作用[7]。目前关于肺部微生态与呼吸系统疾病的主要研究方向为肺部微生物菌群与呼吸系统慢性疾病[8-12]；但对微生物群落组成的分析在急性肺部疾病中的探索较少。本研究基于Illumina高通量测序平台，采用宏基因组测序的方法，研究不同危重程度CAP患儿肺部微生物组学的特征，从而为肺炎患儿的精准诊断及抗生素治疗提供依据，并为肺部微生态在肺炎患儿诊断与治疗中的作用提供新策略和新视野。

1""对象与方法

1.1""研究对象

选择2023年1月至12月荆门市人民医院儿科收治的64例不同危重程度CAP患儿，将患儿分为重症肺炎组（n=34）和普通肺炎组（n=30）。儿童CAP的诊断标准参照《儿童社区获得性肺炎诊疗规范（2019年版）》[1]。重症肺炎组：评估符合《儿童社区获得性肺炎诊疗规范（2019年版）》的诊断标准，在CAP基础上出现以下任何一项：一般情况差、意识障碍、呼吸频率明显增快（婴儿≥70次/min，gt;1岁患儿≥50次/min）、辅助呼吸（呻吟、鼻翕、三凹征）、间歇性呼吸暂停、氧饱和度lt;92%、超高热（持续高热gt;5d）、拒食或脱水症、影像学检查提示（≥2/3一侧肺浸润、多叶肺浸润、胸腔积液、气胸、肺不张、肺坏死、肺脓肿）、有肺外并发症。普通肺炎组：除重度CAP外的儿童。纳入标准："①符合上述儿童CAP的诊断标准；②年龄为生后29d至14岁；③符合支气管镜术的适应证且无禁忌证，家长同意行支气管镜术及宏基因组测序检查，且经监护人同意纳入研究并签署知情同意书。排除标准：①有支气管镜术相对禁忌证：a.严重心肺功能减退者；b.严重心律失常，心房颤动、心室颤动及心房扑动、3度房室传导阻滞者；c.高热，持续高热而又亟须行支气管镜术者，可将其体温降至38.5℃以下再行手术，以防高热惊厥；d.活动性大咯血者、严重的出血性疾病、凝血功能障碍、严重的肺动脉高压及可能诱发大咯血者等；e.严重营养不良，不能耐受手术者。②不符合纳入标准。本研究经荆门市人民医院医学伦理委员会审批通过（伦理审批号：2023092808）。

1.2""研究方法

1.2.1""收集患儿的BALF进行宏基因组测序""按《中国儿科可弯曲支气管镜术指南（2018年版）》[13]要求将支气管镜嵌顿于患儿靶支气管后，经支气管镜工作孔道注入37℃生理盐水[1ml/（kg·次），≤20ml/次，总量≤5～10ml/kg]，再经负压100～200mmHg（1mmHg=0.133kPa）（选择的负压值以吸引时支气管腔不塌陷为宜）的吸引器收集BALF，每次灌洗液的回收率≥40%。由专人进行支气管肺泡灌洗术并正确收集BALF，收集标本后的宏基因组测序工作均委托广州微远基因科技有限公司进行。

1.2.2""数据分析""利用广州微远基因科技有限公司提供的数据对原始测序序列进行质控，筛除误差数据，提高测序结果的准确性和可信度，然后对肺部微生物进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析、物种组成分析、物种差异分析。使用Mothur软件（version"v.1.30）对样品Alpha多样性指数进行评估，通过Alpha多样性分析可反映样本内微生物群落的丰度和多样性，包括Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数。Chao1指数、ACE指数可反映样品微生物的丰富度，估计群落中实际存在的物种数；Shannon指数、Simpson指数可反映样品微生物的多样性。采用Qiime软件（V1.9.1）进行Beta多样性的主坐标分析（principal"coordinate"analysis，PCoA）（主坐标分析是一种非约束性的数据降维分析方法，可研究样本群落组成的相似性或差异性，不同的点代表不同的样本，样本之间的距离表示样本之间的相似性，距离越近，相似性越大），并通过R语言将结果可视化。为研究两组样品间微生物群落丰度的差异，利用R软件对两组间的物种丰度数据进行wilcoxon秩和检验。

1.3""统计学方法

采用SPSS"24.0软件、Mothur软件、Qiime软件、R软件进行统计学分析和绘图。计数资料以率表示，计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用秩和检验；样本间物种丰度差异性分析采用R软件中的秩和检验。n=2，采用R语言中的wilcox.test。Plt;0.05为差异有统计学意义。P值校正通过R（v3.1.1）包中的p.adjust进行。

2""结果

2.1""两组患儿BALF的微生物群落Alpha多样性分析

两组患儿BALF的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数比较，差异均有统计学意义（Plt;0.05），提示普通肺炎组微生物群落丰富度及物种多样性较高，见表1。

2.2""两组Beta多样性分析

两组间Beta多样性的PCoA显示，第一主坐标差异贡献率为45.91%，第二主坐标差异贡献率为16.12%，两个主坐标共解释62.03%的差异，在属水平，两组患儿BALF的微生态菌群组成比较，差异有统计学意义（F=4.221，P=0.005），见图1。

2.3""物种组成分析

经物种分类分析发现，在属水平，两组样本共检测到520个物种，重症肺炎组326个，普通肺炎组463个，重症肺炎组BALF样本中以支原体属为主，其次为链球菌属，第三为嗜血杆菌属；普通肺炎组BALF样本中以链球菌属为主，其次为支原体属，第三为嗜血杆菌属，见图2。

对两组研究对象的微生物种群在属水平层面排名前20位的物种丰度差异进行统计，重症肺炎组高于普通肺炎组物种丰度的有支原体属、棒状杆菌属（Plt;0.05），普通肺炎组高于重症肺炎组物种丰度的有链球菌属、红球菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属、假单胞菌属（Plt;0.05），见表2。

2.4""物种差异性

物种差异性分析显示，在属水平，重症肺炎组与普通肺炎组共有47个物种有差异（Plt;0.05），包括支原体属、链球菌属、红球菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属等，见表3。

3""讨论

宏基因组测序是基于宏基因组学和高通量测序技术，通过直接对临床样本中的核酸进行检测，然后与数据库比对分析得到的序列信息，可检测并分析各种临床来源样本中所有已知及未知的病原体[14-15]。本研究基于Illumina高通量测序平台，采用宏基因组测序的方法，对不同危重程度CAP患儿BALF的微生物组学信息进行分析，可非常全面准确地反映其肺部微生物组学特征。肺部微生物组的改变与机体之间是双向关系，如打破其动态平衡，可致使气道失调和免疫紊乱，从而产生严重的肺部损伤[16-17]。研究认为呼吸道合胞病毒感染后引起的呼吸道微生物菌落组成和多样性的改变，与呼吸道感染的严重程度密切相关[18]。龙鑫等[19]研究发现呼吸道合胞病毒感染可引起呼吸道微生态的菌落组成改变，加重≥6月龄的呼吸道合胞病毒感染患儿的病情。本研究同样发现不同危重程度CAP患儿肺部微生物菌群的改变。Alpha多样性分析发现重症肺炎组和普通肺炎组肺部微生物群落的Chao1指数、ACE指数、Shannon、Simpson指数比较差异有统计学意义。Chao1指数、ACE指数用于衡量微生物群落丰度，指数越大说明群落丰富度越高，Shannon指数、Simpson指数评价物种多样性，Shannon指数越大，Simpson指数越小，物种多样性越高。普通肺炎组Chao1指数、ACE指数明显高于重症肺炎组，表明普通肺炎组微生物群落丰富度明显高于重症肺炎组。普通肺炎组Shannon指数明显高于重症肺炎组，而Simpson指数明显低于重症肺炎组，表明普通肺炎组的肺部微生物菌群多样性明显高于重症肺炎组。Beta多样性分析发现两组患儿微生态菌群组成差异有统计学意义。重症肺炎组患儿的微生物群落丰富度和多样性较普通肺炎组低，说明不同危重程度CAP患儿肺部微生物丰富度和多样性与重症肺炎发生具有相关性。目前有较多研究表明肺部微生物菌群与呼吸系统慢性疾病密切相关，Lee等[11]根据病情严重程度将63例支气管扩张患者分为两组，利用16SrDNA测序技术对其痰微生物组进行研究发现，在属水平上，轻度支气管扩张组的嗜血杆菌和罗氏菌属明显多于中/重度患者组，中/重度患者组的假单胞菌属明显多于轻度组，且差异均有统计学意义。Invernizzi等[12]进行一项前瞻性研究，对受试者的BALF进行16S"rDNA测序，发现特发性肺纤维化患者肺部微生物菌群以厚壁菌门占主导地位，相较于健康对照组，特发性肺纤维化组的厚壁菌门及放线菌门丰度增加，且差异有统计学意义。Yagi等[20]比较慢阻肺患者与健康受试者BALF的微生物组，研究发现慢阻肺患者的莫拉氏菌、链球菌、变形菌、真菌和普雷沃菌相对丰度增加。本研究在属水平对两组CAP患儿BALF样本进行物种分类分析发现，重症肺炎组BALF样本中以支原体属为主，其次为链球菌属，第三为嗜血杆菌属，普通肺炎组则以链球菌属为主，其次为支原体属，第三为嗜血杆菌属，对两组患儿的BALF微生物种群在属水平层面排名前20位的物种丰度差异进行统计，发现重症肺炎组的支原体属、棒状杆菌属丰度明显高于普通肺炎组，而重症肺炎组的链球菌属、红球菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属、假单胞菌属丰度明显低于普通肺炎组，表明重症肺炎组与普通肺炎组的肺部微生物组结构与组成不同，可为临床医生在不同危重程度CAP的抗生素经验性使用选择上提供一定参考。在属水平，对两组患儿的BALF进行物种差异性分析显示，包括支原体属、链球菌属、红球菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属等在内的47个物种存在差异。通过对64例不同危重程度CAP患儿的BALF的宏基因组测序，对比分析其肺部微生态差异，使儿科医生认识其微生态的变化，识别病原体的差异，从而精准地诊断，帮助临床医生精确指导抗生素的治疗，进而减少肺炎并发症，缩短病程，改善预后。关于肺部微生物组是否可靶向治疗及如何靶向治疗，从而改善重症肺炎的结局，还需要进一步研究。富含纤维的饮食可同时改变肺部和肠道的微生物组[21]；营养支持和益生菌的使用可能是维持或恢复功能性肺部微生物组的有效策略。

本研究未动态监测CAP患儿治疗前后的呼吸道菌群改变，也未对比健康儿童的肺部菌群特点，而这可能有助于了解肺炎治疗效果相关的呼吸道菌群改变，未来可纳入更多患者，以更加全面系统地描述肺炎患儿肺部的微生物菌落，进一步探索肺部微生态在肺炎发生、发展中的作用。总之，不同危重程度CAP患儿肺部微生物菌群丰度、多样性及微生物组结构与组成存在差异性，不同危重程度CAP间优势菌群有所不同，本研究丰富了CAP患儿肺部微生物组学数据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国国家卫生健康委员会，"国家中医药局."儿童社区获得性肺炎诊疗规范（2019年版）[J]."中华临床感染病杂志，"2019，"12（1）："6–13.

[2] WOODHEAD"M，"BLASI"F，"EWIG"S，"et"al."Guidelines"for"the"management"of"adult"lower"respiratory"tract"infections-Summary[J]."Clin"Microbiol"Infect，"2011，"17"Suppl"6（6）："1–24.

[3] YUAN"Y，"YE"X，"HUANG"R，"et"al."Clinical"characteristics"of"patients"with"re-admitted"of"novel"coronavirus"2019"（nCOVID-19）"in"Wenzhou，"China[J]."Front"Public"Health，"2021，"9："649178.

[4] WU"X，"LI"Y，"ZHANG"M，"et"al."Etiology"of"severe"community-acquired"pneumonia"in"adults"based"on"metagenomic"next-Generation"sequencing："A"prospective"multicenter"study[J]."Infect"Dis"Ther，"2020，"9（4）："1003–1015.

[5] NGUYEN"L"D"N，"VISCOGLIOSI"E，"DELHAES"L."The"lung"mycobiome："An"emerging"field"of"the"human"respiratory"microbiome[J]."Front"Microbiol，"2015，"6："89.

[6] DUMAS"A，"BERNARD"L，"POQUET"Y，"et"al."The"role"of"the"lung"microbiota"and"the"gut-lung"axis"in"respiratory"infectious"diseases[J]."Cell"Microbiol，"2018，"20（12）："e12966.

[7] MITCHELL"A，"GLANVILLE"A."The"human"respiratory"microbiome："Implications"and"impact[J]."Semin"Respir"Crit"Care"Med，"2018，"39（2）："199–212.

[8] FABBRIZZI"A，"AMEDEI"A，"LAVORINI"F，"et"al."The"lung"microbiome："Clinical"and"therapeutic"implications[J]."Intern"Emerg"Med，"2019，"14（8）："1241–1250.

[9] BARCIK"W，"BOUTIN"R，"SOKOLOWSKA"M，"et"al."The"role"of"lung"and"gut"microbiota"in"the"pathology"of"asthma[J]."Immunity，"2020，"52（2）："241–255.

[10] 盛美玲，"汪群智."慢性阻塞性肺疾病急性加重风险高危与低危患者呼吸道微生态系统差异分析[J]."临床肺科杂志，"2020，"25（12）："1787–1790.

[11] LEE"S"H，"LEE"Y"J，"PARK"J"S，"et"al."Characterization"of"microbiota"in"bronchiectasis"patients"with"different"disease"severities[J]."J"Clin"Med，"2018，"7（11）："429.

[12] INVERNIZZI"R，"WU"B"G，"BARNETT"J，"et"al."The"respiratory"microbiome"in"chronic"hypersensitivity"pneumonitis"is"distinct"from"that"of"idiopathic"pulmonary"fibrosis[J]."Am"J"Respir"Crit"Care"Med，"2021，"203（3）："339–347.

[13] 国家卫生健康委员会人才交流服务中心儿科呼吸内镜诊疗技术专家组，"中国医师协会儿科医师分会内镜专业委员会，"中国医师协会内镜医师分会儿科呼吸内镜专业委员会，"等."中国儿科可弯曲支气管镜术指南（2018年版）[J]."中华实用儿科临床杂志，"2018，"33（13）："983–989.

[14] 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组."宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J]."中华急诊医学杂志，"2019，"28（2）："151–155.

[15] 江苏省医学会检验学分会，"江苏省临床检验中心."宏基因组测序技术检测感染性病原体江苏专家共识（2020版）[J]."临床检验杂志，"2020，"38（9）："641–645.

[16] DICKSON"R"P，"ERB-DOWNWARD"J"R，"MARTINEZ"F"J，"et"al."The"microbiome"and"the"respiratory"tract[J]."Annu"Rev"Physiol，"2016，"78（1）："481.

[17] DANG"A"T，"MARSLAND"B"J."Microbes，"metabolites，"and"the"gut-lung"axis[J]."Mucosal"Immunol，"2019，"12（4）："843–850.

[18] ROSAS-SALAZAR"C，"TANG"Z"Z，"SHILTS"M"H，"et"al."Upper"respiratory"tract"bacterial-immune"interactions"during"respiratory"syncytial"virus"infection"in"infancy[J]."J"Allergy"Clin"Immunol，"2022，"149（3）："966–976.

[19] 龙鑫，"石珮入，"罗征秀，"等."上呼吸道肺炎链球菌定植对呼吸道合胞病毒感染患儿临床表现的影响[J]."中华儿科杂志，"2022，"60（7）："694–699.

[20] YAGI"K，"HUFFNAGLE"G，"LUKACS"N，"et"al."The"lung"microbiome"during"health"and"disease[J]."Int"J"Mol"Sci，"2021，"22（19）："1–13.

[21] MOHANA"R，"HUIWEN"T"E，"YI"S"J，"et"al."Novel"strategies"in"immunotherapy"for"allergic"diseases[J]."Asia"Pac"Allergy，"2018，"8（2）："e14.

（收稿日期：2024–09–23）

（修回日期：2024–12–24）