基于UPLC-Q-TOF-MS法分析陈皮中的化学成分

黄晓媛 李焱鑫 董浩 赵文红 白卫东 钱敏 毕思远

摘要：利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）结合数据分析平台在线分析陈皮中71种化学成分，包括黄酮类、生物碱、香豆素和脂类等9类。通过主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）发现不同陈化年份陈皮中的化学成分具有明显差异，并筛选出17种特征性成分，随着陈化年份的延长，异甘草苷、山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷、百蕊草素Ⅰ含量增加，脱水红花黄色素B、补骨脂查尔酮含量减少。此方法可用于区分陈化3，5，10，15，20年的陈皮。该研究了解了陈皮中化学组成并阐明了不同陈化年份陈皮间化学成分存在的差异，对合理开发陈皮的食用和药用价值具有指导意义，为不同陈化年份陈皮的鉴别提供了科学依据。

关键词：陈皮；化学成分；UPLC-Q-TOF-MS；黄酮类物质

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）04-0166-07

Analysis of Chemical Components of Citri Reticulatae Pericarpium

Based on UPLC-Q-TOF-MS

HUANG Xiao-yuan1， LI Yan-xin1， DONG Hao1，2， ZHAO Wen-hong1，2，

BAI Wei-dong1，2， QIAN Min1，2*， BI Si-yuan3

（1.College of Light Industry and Food Science， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，

Guangzhou 510225， China; 2.Institute of Modern Agricultural Engineering Innovation， Key Laboratory

of Green Processing and Intelligent Manufacturing of Lingnan Specialty Food， Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Key Laboratory of Science and Technology of Lingnan

Specialty  Food in Guangdong Province， Zhongkai University of Agriculture and

Engineering， Guangzhou 510225， China;3.Shenzhen King Eye Testing

Technology Co.， Ltd.， Shenzhen 518120， China）

Abstract： A total of 71 kinds of chemical components including nine categories such as flavonoids， alkaloids， coumarins， lipids and so on from Citri Reticulatae Pericarpium are analyzed online by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） combined with data analysis platform. By principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）， it is found that the chemical components in Citri Reticulatae Pericarpium with different aging years are significantly different， and 17 kinds of characteristic components are screened out. With the extension of aging years， the content of isoliquiritin，

收稿日期：2023-09-14

基金項目：四川省重点研究基地——川菜发展研究中心规划项目（CC22Z18）；广东省驻镇帮镇扶村农村科技特派员项目（KTP20210224，KTP20210383）；广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室项目（20211212040013）；仲恺农业工程学院-深圳市一米厨房餐饮管理有限公司联合培养研究生示范基地项目（KA23YY40519）；广东省仲恺农业工程学院-广州质量监督检测研究院联合培养研究生示范基地项目（粤教研函[2021]2号）；仲恺农业工程学院研究生教育创新计划项目（KA220160221）

作者简介：黄晓媛（1997—），女，硕士，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：钱敏（1983—），女，高级实验师，硕士，研究方向：食品化学、食品加工与品质安全控制。

kaempferol-3-O-β-D-sophoroside and thylitonin I increases， and the content of dehydrated safflower yellow pigment B and psoralen chalcone decreases. This method can be used to distinguish Citri Reticulatae Pericarpium aged for 3， 5， 10， 15， 20 years. In  this study， the chemical composition of Citri Reticulatae Pericarpium is understood and the differences of chemical composition of Citri Reticulatae Pericarpium with different aging years are discussed， which has guiding significance for the rational development of Citri Reticulatae Pericarpium with edible and medicinal value and has provided a scientific basis for the identification of Citri Reticulatae Pericarpium with different aging years.

Key words： Citri Reticulatae Pericarpium; chemical components; UPLC-Q-TOF-MS; flavonoids

陈皮是由成熟柑橘皮经一段时间储藏干制而成的药食同源食品，具有理气健脾、燥湿化痰的功能[1]。陈皮富含多种生物活性物质，包括类黄酮、类胡萝卜素、生物碱、精油、酚酸、萜类化合物等[2]，且具有药用价值。随着这些功效组分的生物活性、藥理作用机制等的明晰，陈皮中生物活性物质的研究受到广泛关注，其中类黄酮作为重要的一类活性物质，在芸香科柑橘属的研究中均有涉及[3]。类黄酮是指一类以2-苯基色原酮（C6-C3-C6）为基本骨架的天然酚类化合物，其结构中含有酚羟基、甲基、甲氧基等取代基团[4]。目前柑橘属中发现的类黄酮多以糖苷的形式存在，主要为黄烷酮、黄酮和黄酮醇。其中，含有4个及以上甲氧基取代基的类黄酮称为多甲氧基黄酮（polymethoxylated flavonoids，PMFs），主要分布在芸香科植物属中，因其具有较多的甲氧基团和较高的亲脂性，因此比一般黄酮的生物利用度更高、生物活性更强[5]。

陈皮陈化年份不同，在药理作用、化学成分含量上存在差异，市场价格同样存在较大差别，质量标准未完善，因此市场上常出现以次充好的现象。对于陈皮年份的鉴别与分析多使用感官评价法[6]、拉曼光谱法[7]、高效液相色谱法[8]、液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法等[9-11]。感官评价法是对陈皮的外观、香气等外部特征进行判别，具有快速简便、操作简单的优势，但陈皮年份鉴别的准确度易被主观条件、客观环境因素所干扰。理化检测法主要通过对陈皮中的成分组成和含量进行测定以实现不同年份陈皮的鉴别分析，准确度和精密度高，而样品的前处理方法繁琐、检测时间长、检测成本高。前人大多针对陈皮中某类或某些黄酮类化合物进行定量研究，针对整体化学成分特征进行系统比较分析的研究较少。

本文以陈化3，5，10，15，20年的陈皮为材料，采用高效液相色谱-高分辨质谱联用法等技术对陈皮的化学成分进行鉴定，该结果为进一步分析不同陈化年份的陈皮提供了详细数据，对进一步研究陈皮物质基础具有一定指导意义，为今后陈皮及其同属中药的化学成分研究和品质评价提供了较好的借鉴方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3，5，10，15，20年广东新会陈皮：购于新会地区某固定农户，分别编号为A、B、C、D、E；甲酸（色谱纯）：天津赛孚瑞科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国 Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290 HPLC-6545B-Q-TOF-MS（配有双喷射流电喷雾离子源） 美国Agilent公司；十万分之一电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Eppendorf Centrifuge台式高速离心机 广州卓岳贸易有限公司；KQ5200V超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；XW-80A漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取100 mg陈皮，与10 mL甲酸、水和甲醇（4∶36∶160）混合提取，超声20 min，漩涡1 min，离心4 min取上清液，将上清液组分氮吹至3 mL。固相萃取活化柱子先用3 mL 1%甲酸-甲醇活化，再用3 mL 0.1%甲酸-水活化。3 mL样品装在SPE柱上，用0.1%甲酸-水冲洗，然后用0.1%甲酸-甲醇洗脱，用固相萃取法（Oasis HLB萃取柱）从水相组分中提取黄酮[12]。

1.3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析条件

色谱条件：Shim-pack Scepter C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×3 μm），流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈，梯度洗脱。流动相B的比例：0～10 min，5%～20% B；10～30 min，20%～50% B；30～40 min，50%～90% B；流速为0.3 mL/min；柱温为 30 ℃，进样量为5 μL[13]。

质谱条件：电喷雾离子源采用正/负离子源模式；干燥气温度300 ℃；干燥气流速6 L/min；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；雾化器压力35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛细管电压3.5 kV；喷嘴电压1 kV；质量扫描范围（m/z）100～1 000 amu；采集模式：全扫描，Auto MS/MS[14-15]。

2 结果与讨论

2.1 不同陈化年份陈皮的化学成分

按照1.3.2中色谱和质谱条件对陈皮样品进行分析，对色谱图中各色谱峰进行精确质量数识别。通过分子离子峰精确质量数、二级谱图等信息，结合文献与化合物数据库，对样品中71种成分进行了鉴定，见表1[16-19]。

结果表明，不同陈化年份陈皮中的化学成分相似，主要化学成分种类在3，5，10，15，20年陈皮中基本无差别，但化合物含量存在一定差异。鉴定的71种化学成分主要包括黄酮类（23种）、黄酮苷类（15种）、生物碱类（7种）、香豆素类（4种）、萜类（4种）、酯类（3种）、木质素（2种）、酚类（2种）、其他类（6种）。陈皮中的黄酮类和黄酮苷类化合物较丰富，用该方法能检测到陈皮中橘皮素、甜橙黄酮、异橙黄酮、橙皮苷、橙皮素、二氢杨梅素、芸香柚皮苷和柚皮苷等重要的活性成分。

由表1可知，在生物活性成分种类方面，本研究共鉴定了71种生物活性成分，包括38种黄酮和黄酮苷类化合物、7种生物碱、4种香豆素、2种酚类、1种柠檬苦素类，其中3，5，10，15，20年陈皮分别筛查鉴定出37，34，34，38，38种生物活性成分。不同陈化年份陈皮黄酮类化合物种类筛查鉴定排序：陈化20年陈皮（31种）＞陈化15年陈皮（30种）＞陈化3年陈皮（29种）＞陈化10年陈皮（25种）＞陈化5年陈皮（24种）。其中20种黄酮类化合物为共同检出的化合物，包括芸香柚皮苷、柚皮苷、水仙苷、异甘草苷、高车前苷、虎杖苷、橘皮素、甜橙黄酮、橙皮素、5，7，8，4′-四甲氧基黄酮等。7种生物碱中，石斛碱为陈化20年陈皮所特有，白屈菜碱为陈化3年和20年陈皮所独有。巴马亭红碱、荷叶碱、小檗碱为不同陈化年份陈皮中共同检出的。

从陈皮中共鉴定出38种黄酮和黄酮苷类化合物。黄酮类化合物泛指2个苯环通过中央3个碳原子互相连接而成的具有C6-C3-C6基本骨架的化合物，在其A环和B环上常连接甲基或者甲氧基等官能团，并且常与糖结合成苷。黄酮类化合物的主要裂解方式以糖苷键断裂，狄尔斯-阿尔德反应（RDA）裂解，CO2、CO等中性离子丢失为主[20]。

由图1可知，化合物cpd 321在正离子模式下产生准分子离子峰[M-H] m/z 373.130 4，根据高分辨数据拟合其元素组成为C20H20O7，初步推断为橘皮素。为进一步确定结构，对m/z 373.130 4进行二级全扫描质谱分析，产生的主要碎片离子有m/z 389.124 8，328.268 2，与文献报道一致[21]。

由图2可知，化合物cpd 183在正离子模式下产生准分子离子峰[M-H] m/z 581.187 9，根据高分辨数据拟合其元素组成为C27H32O14，初步推断为芸香柚皮苷。为进一步确定结构，对m/z 581.187 9进行二级全扫描质谱分析，产生的主要碎片离子有m/z 473.218 0，295.117 9，与文献报道一致[22]。

由图3可知，化合物cpd 104在正离子模式下产生准分子离子峰[M-H] m/z 611.200 2，根据高分辨数据拟合其元素组成为C28H34O15，初步推断为橙皮苷。为进一步确定结构，对m/z 611.200 2进行二级全扫描质谱分析，产生的主要碎片离子有m/z 303.087 2，177.055 5，与文献报道一致[23]。

甜橙黄酮、异橙黄酮、柚皮苷、橙皮素是陈皮等芸香科植物中较常见的黄酮类物质，其鉴定过程与上述3种化合物的鉴定类似[24-25]。由表1可知，陈皮中的黄酮类化合物较丰富，但未使用对应标准品进行定量分析，因此还需要进一步研究。

2.2 基于UPLC-Q-TOF-MS的不同陈化年份陈皮中化学成分差异研究

将峰匹配、峰面积提取得到的71种化合物离子进行主成分分析（PCA），了解不同样品间总体化合物差异变异度大小[24]。

由图4中a可知，PCA模型参数为 R2X=0.203（R2X为模型对X变量的解释性），说明拟合性较好，模型较稳定。所有陈皮样品坐标点均分布于95%置信区域，在PCA图上不同陈化年份陈皮样品均能分散开，但组间差异较大，可能是因为PCA是无监督分析模型，因此存在一定的组内误差，需要深入分析探究，消除无关误差[25]。利用正交偏最小二乘判别分析的监督性将与分类变量无关的信息滤除，充分提高了模型的效力和解析能力，排除组间的误差及其他无关误差，以便最大化得到组间差异成分[26]。由图4中b可知不同陈化年份陈皮的OPLS-DA得分图（R2X=0.993，R2Y=0.99），可以看出不同陳化年份之间有明显的分离趋势，表明不同陈化年份陈皮中成分存在差异。由图4中c可知，通过对OPLS-DA模型进行200次置换模拟可知模型无过拟合，同时在OPLS-DA分布图上可以将不同陈化年份陈皮很好地区分。变量重要因子（VIP）表示OPLS-DA模型中每个化合物对差异作出的贡献值。VIP值越大，说明对OPLS-DA模型的分类贡献越大，表明该化合物在不同陈化年份陈皮中的含量存在较大差异。由图4中d可知，不同陈化年份陈皮中共筛选出17种特征化合物（VIP＞1），包括芒柄花苷、橘皮素、甜橙黄酮、脱水红花黄色素B、5，7，8，4′-四甲氧基黄酮、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异甘草苷、水仙苷、异橙黄酮、白绵马素AA、虎杖苷、7-甲氧基香豆素、补骨脂查尔酮、黄独素B、邻苯二甲酸二丁酯、山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷、百蕊草素Ⅰ，结合表1可知黄酮类化合物占12种，由此表明黄酮类化合物是陈皮陈化过程中影响陈皮品质的重要活性物质[27]。

进一步将这17种显著差异化合物导入TBtools软件做热图聚类分析，结果见图5。热图中横向为差异化合物，纵向为3，5，10，15，20年陈皮样品，浅色代表化合物相对含量低于平均值，深色代表化合物相对含量高于平均值。

由图5可知不同陈化年份陈皮样品的代表性差异化合物的相对含量。异甘草苷、山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷、百蕊草素Ⅰ相对含量随着陈化年份的延长而增加。异甘草苷具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗哮喘、抗炎、抗微生物、抗痉挛等药理作用，同时在护肝、免疫等活动中有不同的作用，还可以刺激头发生长，控制肥胖，并且具有抗抑郁、镇静和抗凝血活性[28]。脱水红花黄色素B、补骨脂查尔酮相对含量随着陈化年份的延长而减少。槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、黄独素B相对含量随着陈化年份的延长呈先增加后减少的趋势，异橙黄酮、橘皮素、甜橙黄酮在陈化15年陈皮中含量最高。

3 结论

利用UPLC-Q-TOF-MS技术测定不同陈化年份陈皮中的化学成分，并对其进行快速和精准的鉴定[29]。利用主成分分析对测定到的71种化学成分成功实现降维，由PCA和OPLS-DA得分结果可以将陈皮根据年份的不同分为5类，并筛选到17种陈皮陈化过程中具有显著变化的差异物质，由聚类分析可知，随着陈化年份的延长，甘草苷、山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷、百蕊草素Ⅰ逐渐增加，脱水红花黄色素B、补骨脂查尔酮逐渐减少，异橙黄酮、橘皮素、甜橙黄酮在陈化15年陈皮中含量最高。

综上所述，运用UPLC-Q-TOF-MS结合主成分分析和聚类热图分析可实现快速分析，发挥各自优势，互相验证和补充，多角度综合评判陈皮[30]。然而，对17种差异物质尚未进行定量研究。在今后的研究中，应结合质谱对其进行定性、定量。同时扩大采样范围，加强研究的系统性和深入性，使研究结果更具有实用价值。

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