核桃粕酱油的研制及品质分析

谭春雷 盛军 赵存朝

摘要：以螺旋壓榨核桃粕、超临界萃取核桃粕和重力压榨核桃粕为原料，考察发酵时间、发酵温度、料液比和盐水浓度对酱油发酵过程中氨基酸态氮含量的影响，并对酱油的理化指标进行分析。研究发现，当发酵时间为32 d、发酵温度为42 ℃、料液比为1∶1.2、盐水浓度为13%时，3种核桃粕所得酱油中氨基酸态氮含量达到最高，分别为0.75，0.56，0.65 g/100 g。对3种成品酱油进行理化指标检测，3种酱油总氮含量分别为1.05，0.93，0.95 g/dL，无盐固形物含量分别为11.15，11.27，11.67 g/dL，均符合相应国家标准。在3种酱油中共检测出16种游离氨基酸，其中螺旋压榨核桃粕所制酱油中游离氨基酸总量最高，达6.16 g/dL，超临界萃取核桃粕和重力压榨核桃粕所制酱油中氨基酸总量分别为5.02，5.20 g/mL。研究表明3种核桃粕用来制作酱油的适合程度为螺旋压榨核桃粕＞重力压榨核桃粕＞超临界萃取核桃粕。核桃粕酱油的研制可为云南核桃产业的发展提供理论基础，同时可促进云南酱油产业的发展。

关键词：核桃粕酱油；发酵工艺；响应面法；游离氨基酸

中图分类号：TS264.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）04-0154-07

Development and Quality Analysis of Walnut Meal Soy Sauce

TAN Chun-lei1， SHENG Jun1， ZHAO Cun-chao1，2，3*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2.Yunnan Plateau Characteristic Agricultural Industry Research Institute， Kunming 650201，

China; 3.Characteristic Resource Food Biological Manufacturing Engineering

Research Center in Yunnan Province， Kunming 650201， China）

Abstract： With spiral squeezed walnut meal， supercritical extracted walnut meal and gravity squeezed walnut meal as the raw materials， the effects of fermentation time， fermentation temperature， solid-liquid ratio and brine concentration on the amino acid nitrogen content during soy sauce fermentation are investigated， and the physicochemical indexes of soy sauce are analyzed. The results show that when the fermentation time is 32 d， the fermentation temperature is 42 ℃， the ratio of solid to liquid is 1∶1.2， and the brine concentration is 13%， the amino acid nitrogen content of the three kinds of walnut meal soy sauce reaches the highest， which is 0.75， 0.56， 0.65 g/100 g respectively. The detection of physicochemical indexes of the three finished soy sauce products shows that the total nitrogen content of the three kinds of soy sauce is 1.05， 0.93， 0.95 g/dL respectively， and the salt-free solid content is 11.15， 11.27， 11.67 g/dL respectively， which all meet the corresponding national standards. A total of 16 kinds of free amino acids are detected in the three kinds of soy sauce， among which， the total amount of free amino acids in soy sauce prepared by spiral squeezed walnut meal is the highest of 6.16 g/dL， and the total amount of amino acids in soy sauce prepared by supercritical extracted walnut meal and gravity squeezed walnut meal is 5.02， 5.20 g/mL respectively. The results show that the appropriate degree of the three kinds of walnut meals for making soy sauce is spiral squeezed walnut meal>gravity squeezed walnut

收稿日期：2023-09-11

作者简介：谭春雷（1998—），男，硕士，研究方向：功能食品。

*通信作者：赵存朝（1990—），男，研究实习员，硕士，研究方向：食品科学。

meal>supercritical extracted walnut meal. The preparation of walnut meal soy sauce can provide a theoretical basis for the development of Yunnan walnut industry and promote the development of Yunnan soy sauce industry.

Key words： walnut meal soy sauce; fermentation process; response surface method; free amino acid

核桃因富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素等营养成分而广受人们的喜爱[1]。目前核桃除直接食用外，深加工产品主要为核桃蛋白粉、核桃油、核桃乳饮料等[2]。其中核桃油作为最主要的加工产品，也因含有大量的亚油酸、亚麻酸等可以改善记忆力的不饱和脂肪酸而深受消费者的青睐[3]。生产核桃油的同时会产生大量的副产物核桃粕，目前仅有少量核桃粕被用于加工制作蛋白粉，大部分被用于动物饲料或者直接丢掉[4]，造成了极大的资源浪费。

不同方法制作核桃油所产生的核桃粕种类与营养成分具有一定的差异，目前核桃油的生产方法主要为压榨法、浸提法和超临界萃取法，随之产生的核桃粕中含有丰富的蛋白质、维生素和多糖等营养物质。有关研究报道，不同种类的核桃粕中蛋白质含量在19%～56%之间[5]，因此许多企业以核桃粕为原料提取核桃蛋白，或者进一步加工制作成营养蛋白粉，来解决核桃粕的加工利用问題，但对于核桃粕的利用却远远不够。酱油是一种营养丰富、口感独特的酿造产品，主要以大豆或豆粕为主要原料，经米曲霉制曲、发酵酿制而成[6]。此外，利用牡丹籽粕、花生粕等原料生产酱油也有报道，以核桃粕为原料酿造酱油可以解决目前酱油原料单一、功能不足等问题[7]。

针对核桃粕利用不足和酱油原料单一的问题，本研究以3种不同的核桃粕（螺旋压榨核桃粕、重力压榨核桃粕和超临界萃取核桃粕）为原料，采用低盐固态法酿造核桃粕酱油，对发酵过程进行系统研究，考察发酵温度、发酵时间、料液比和盐水浓度对氨基酸态氮含量的影响，在单因素试验的基础上采用响应面法优化最佳发酵工艺，并对所得3种酱油中的总氮含量、氨基酸态氮含量和游离氨基酸含量等理化指标进行测定，探究不同种类核桃粕用于酱油生产的可行性。本研究既有利于拓宽核桃粕的加工利用途径，又可以拓宽酱油的原料来源。

1 材料和方法

1.1 材料

螺旋压榨核桃粕和重力压榨核桃粕：云南昆明老三监酱油厂；超临界CO2萃取核桃粕：云南一叶生物科技股份有限公司；米曲霉3.042：济宁祥园生物科技有限公司；食盐：云南省盐业有限公司；小麦粉：郑州天地人面粉实业有限公司。

1.2 试剂

盐酸、乙醇、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚绿（均为分析纯）：由云南农业大学提供；硼酸、甲醛、冰乙酸、无水硫酸钠、石油醚、丙酮（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

HPX-9272ME 恒温培养箱 上海博迅实业有限公司；pH计量仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；YP20002电子天平 上海光正医疗仪器有限公司；KN520凯氏定氮仪 上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV2355紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；氨基酸自动分析仪 德国Sykam（赛卡姆）公司。

1.4 方法

1.4.1 原料成分的测定

蛋白质含量按照GB 5009.5—2016进行测定；粗脂肪含量按照GB/T 6433—2006进行测定；水分含量按照GB/T 10358—2008进行测定；灰分含量按照GB 5009.4—2016进行测定。

1.4.2 工艺流程和操作要点

参考蔺立杰[8]的研究方法制定工艺流程：核桃粕、小麦粉混合→润水（30 min）→蒸煮灭菌（120 ℃、30 min）→冷却至40 ℃→接种（接入原料重量0.7%的米曲霉）→制曲（32 ℃、42 h）→盐水发酵→淋油（90 ℃沸水浸泡12 h）→成品。

原料润水：将核桃粕粉碎，与小麦粉按4∶1的比例混合，加入原料总重量120%的水润水30 min。

蒸煮灭菌：将润水后的原料置于120 ℃的环境下蒸煮30 min。

接种：蒸煮后的原料冷却至40 ℃时接种原料重量0.7%的米曲霉。

制曲：将接种后的原料转入恒温培养箱中进行制曲，控制制曲温度为32 ℃，制曲时间为42 h，每隔6 h翻曲一次防止烧曲，当曲料疏松、存在大量孢子时即制曲成功。

发酵：将适量盐水与粉碎成曲混匀装入发酵器皿中，置于恒温培养箱中保温发酵40 d左右，得到成熟酱醅。

淋油：在成熟酱醅中加入90 ℃的蒸馏水将酱醅浸泡12 h进行沉淀，之后离心取上清液得到生酱油，将螺旋压榨核桃粕酱油记为Y1、超临界萃取核桃粕酱油记为Y2、重力压榨核桃粕酱油记为Y3进行理化指标检测。

1.4.3 单因素试验

以氨基酸态氮含量为指标，选取不同盐水浓度（10%、11%、12%、13%、14%）、不同料液比（1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6）、不同发酵温度（36，38，40，42，44 ℃）、不同发酵时间（8，16，24，32，40 d）对发酵条件进行初步优化，确定较佳因素试验参数范围，每个处理重复3次，结果取平均值。

1.4.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken法进行发酵工艺的优化，因素水平见表1。

1.4.5 成品酱油理化指标的测定

可溶性固形物、全氮和氨基酸态氮含量按照GB 18186—2000进行测定；游离氨基酸含量按照GB 5009.124—2016进行测定；总酸含量按照GB 12456—2021进行测定；色泽采用紫外可见分光光度计进行测定；pH直接使用pH计进行测定。

1.5 数据处理

采用Excel进行数据统计，Origin 2021进行绘图处理，SPSS 27.0进行单因素方差分析，Design-Expert 13进行响应面设计。

2 结果与分析

2.1 3种核桃粕基本成分比较

由表2可知，3种不同类型的核桃粕的基本理化指标存在一定差异，螺旋压榨核桃粕的蛋白质含量最高，达到43.54 g/100 g，而重力压榨核桃粕和超临界萃取核桃粕的蛋白质含量分别为33.01 g/100 g和31.40 g/100 g。与此相对的是超临界萃取核桃粕的粗脂肪含量达到19.37 g/100 g，远高于螺旋压榨核桃粕和重力压榨核桃粕的粗脂肪含量，造成这种差异的原因是压榨法较超临界萃取法发展时间长、工艺更成熟、出油率更高，从而所得核桃粕中的粗脂肪含量较少[9]。此外，螺旋压榨核桃粕和重力压榨核桃粕中的灰分含量高于超临界萃取核桃粕，这是因为压榨过程中会带入一些核桃壳，从而引起核桃粕的灰分含量过高[10]。研究表明大豆含18%～22%的油脂和40%左右的蛋白质，核桃粕成分组成与其接近，开发前景与大豆相似，初步说明核桃粕可以用作酱油发酵的原料。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 发酵温度对氨基酸态氮含量的影响

发酵温度会影响米曲霉的酶活性，进而影响氨基酸态氮含量。选定发酵时间为32 d、料液比为1∶1.2、盐水浓度为12%，以不同的溫度进行发酵，考察发酵温度对氨基酸态氮含量的影响，见图1。

由图1可知，当发酵温度从36 ℃上升到42 ℃期间，3种酱油的氨基酸态氮含量随着温度的升高而增多，螺旋压榨核桃粕酱油中氨基酸态氮含量最高，而超临界萃取核桃粕酱油中氨基酸态氮含量最低。当温度高于42 ℃时氨基酸态氮含量减少，这是因为温度过高会抑制酶的活性，同时可能会加快美拉德反应的进行，消耗氨基酸[11]。胡伊等[12]使用牡丹籽粕发酵酱油时同样得到相似的结论。在此基础上，选择发酵温度为40～44 ℃进行后续试验。

2.2.2 发酵时间对氨基酸态氮含量的影响

选定发酵温度为40 ℃、料液比为1∶1.2、盐水浓度为12%，以不同的时间进行发酵，考察发酵时间对氨基酸态氮含量的影响，见图2。

由图2 可知，随着发酵时间的延长，氨基酸态氮含量不断增加，当发酵时间为32 d时，氨基酸态氮含量达到最大，3种酱油中氨基酸态氮含量为Y1＞Y3＞Y2。这是因为若发酵时间不足，蛋白质未被完全分解[13]。当发酵时间超过32 d时，酱油中氨基酸态氮含量基本未发生变化，这是因为发酵后期酶活力下降，同时酵母菌与耐盐乳酸菌繁殖，从而使米曲霉的生长繁殖受到影响[14]。结合试验结果与试验成本，选择发酵时间为32 d进行后续试验。

2.2.3 料液比对氨基酸态氮含量的影响

选定发酵时间为32 d、发酵温度为40 ℃、盐水浓度为12%，以不同的料液比进行发酵，考察料液比对氨基酸态氮含量的影响，见图3。

由图3可知，当料液比为1∶1.2时，氨基酸态氮含量达到最大；当料液比大于1∶1.2时，氨基酸态氮含量逐渐降低，这是因为适当的水分有助于米曲霉的生长，使蛋白质得到更好的利用，但随着水分含量的增加，盐分也随之增加，从而抑制了米曲霉的生长，导致氨基酸态氮含量下降[15]。在此基础上，选择料液比为1∶1～1∶1.4进行后续试验。

2.2.4 盐水浓度对氨基酸态氮含量的影响

盐对维系食品发酵体系中的微生物群落具有重要作用[16]。选定发酵时间为32 d、发酵温度为40 ℃、料液比为1∶1.2，以不同的盐水浓度进行发酵，考察盐水浓度对氨基酸态氮含量的影响，见图4。

由图4可知，当盐水浓度为10%～13%时，随着盐水浓度的增加，酱油中氨基酸态氮含量逐渐增加，且3种酱油中氨基酸态氮含量为Y1＞Y3＞Y2，这是3种核桃粕中蛋白质含量不同导致的。当盐水浓度超过13%时，酱油中氨基酸态氮含量呈下降趋势，这是因为盐水浓度过低时，杂菌大量繁殖，从而使米曲霉的生长受到影响，而盐水浓度过高时，蛋白酶活力受到抑制，从而使蛋白质的分解降低[17]。因此，选择盐水浓度为12%～14%进行后续试验。

2.3 响应面法优化试验设计及结果分析

在单因素试验的基础上，以氨基酸态氮含量为指标，采用Box-Behnken法进行试验设计，确定3种核桃粕酱油最佳发酵工艺参数，试验设计及结果见表3。

对表3中试验数据进行二次多项回归拟合，得到的3组多元回归方程相关系数分别为R12=0.959 8，R1Adj2=0.908 2；R22=0.987 1，R2Adj2=0.970 5；R32=0.961 6，R3Adj2=0.912 2，表明该模型的拟合程度良好，可用来反映响应值的变化。3种核桃粕酱油中氨基酸态氮含量对发酵温度（A）、料液比（B）、盐水浓度（C）的多元回归方程分别为Y1=0.742 0+0.053 8A+0.05B+0.028 8C+0.012 5AB＋0.005AC+0.052 5BC－0.093 5A2－0.071B2－0.033 5C2；Y2=0.538+0.017 5A+0.017 5B－0.002 5C+0.03AB－0.035AC+0.03BC－0.074A2－0.044B2－0.009C2；Y3=0.632+0.017 5A+0.016 3B－0.006 3C+0.007 5AB＋0.012 5AC－0.01BC－0.038 5A2－0.046B2－0.041C2。方差分析见表4～表6。

由表4～表6可知，3组响应面模型的F值分别为18.58，19.47，59.43，P值均＜0.01，极具显著性，失拟项不显著，说明试验随机误差较小。由表4和表6可知，发酵温度（A）和料液比（B）对模型的影响极显著，3个因素对氨基酸态氮含量的影响次序为发酵温度>料液比>盐水浓度。由表5和表6可知，盐水浓度（C）对模型的影响不显著。

由图5可知，发酵温度、料液比和盐水浓度的改变均会影响3种核桃粕酱油氨基酸态氮的含量，发酵温度、料液比和盐水浓度三者之间均存在交互作用，通过响应面的陡峭程度可以看出，发酵温度的影响大于料液比和盐水浓度的影响，与方差分析结果一致。最终通过试验预测得出理论最优条件为发酵温度（A）42.4 ℃、料液比（B）1∶1.24、盐水浓度（C）12.8%时，3种酱油中氨基酸态氮含量分别可达0.76，0.54，0.64 g/100 g。

2.4 最佳工艺条件试验验证

为验证回归模型的可靠性，对最优条件进行验证。考虑实际情况，将响应因素选定为发酵温度42 ℃、料液比1∶1.2、盐水浓度13%、发酵时间32 d，此时氨基酸态氮含量平均值分别为0.75，0.56，0.65 g/100 g，相对误差分别为1.33%、3.57%、1.54%，说明3组模型均可较好地预测3种核桃粕酱油中氨基酸态氮的含量。

2.5 基本理化成分分析

3种酱油的基本理化成分见表7。

由表7可知，3种酱油的总氮含量分别为1.05，0.93，0.95 g/dL，无盐固形物含量分别为11.15，11.27，11.67 g/dL，符合相应的国家标准，说明核桃粕可以代替大豆成为酱油的蛋白原料，这与蔺立杰[8]的结论一致。氨基酸态氮为酱油提供鲜味，是米曲霉分解蛋白质的产物，它的含量越高，说明蛋白质利用越充分，酱油品质越好[18]。发酵结束后，Y1的氨基酸态氮含量达到0.75 g/100 g，高于Y2与Y3的氨基酸态氮含量，这可能是因为螺旋压榨核桃粕更易被米曲霉利用。酸度会影响酱油的口感，主要是由发酵过程中的乳酸菌产生的。酱油除了调味外，调色也是它的重要作用[19]，酱油的色泽主要由L* （亮度）、a* （红绿值）、b* （黄蓝值）决定，Y1的L*值要远高于其他两种酱油，这说明Y1的光泽度优于Y2、Y3，并且Y1的a*值和b*值也最高，这进一步证明了Y1的色泽在3种酱油中最佳。由酱油的理化指标可以初步判断出用于酿造酱油的3种核桃粕的适宜程度为螺旋压榨核桃粕＞重力压榨核桃粕＞超临界萃取核桃粕。

2.6 游离氨基酸分析

氨基酸在酱油中起重要的呈味作用，氨基酸含量越高，酱油的滋味越好，鲜味越浓[14]。同时氨基酸在人体调节代谢过程中起重要作用，如缬氨酸是合成各类抗体、激素和酶等的前体物质[20]，精氨酸会参与尿素、肌酸、NO、谷氨酰胺等的合成[21]。

由表8可知，16种游离氨基酸被检测到，3种酱油中游离氨基酸总量最高的是Y1，最低的是Y2，与氨基酸态氮含量的顺序一致。由图6可知，Y2和Y3聚为一类，Y1单独聚为一类，这是由于核桃粕的处理方式不同，蛋白质的含量与种类不同，从而造成氨基酸含量的差异。不同的氨基酸会呈现不同的滋味特征[22]。谷氨酸和天冬氨酸呈鲜味，3种酱油中鲜味氨基酸含量最高的是Y1，同时Y1中甜味和苦味氨基酸的含量也最高，与之相对应的是Y2中鲜味氨基酸含量最低，这进一步说明螺旋压榨核桃粕更适合用来制作酱油。

3 结论

本试验对3种核桃粕的成分进行研究，发现螺旋压榨核桃粕中蛋白质含量最高，油脂含量低，可以作为酱油酿造的蛋白原料。在发酵条件优化过程中发现，当发酵时间32 d、料液比1∶1.2、发酵温度42 ℃、盐水浓度13%时，3种酱油中氨基酸态氮含量最高。对3种酱油的理化指标进行检测，发现3种酱油均达到国家标准的基本要求，表明核桃粕可以作为酱油发酵的蛋白原料。通过对氨基酸进行检测发现，螺旋压榨核桃粕酱油中氨基酸总量和鲜味氨基酸含量远高于其他两种酱油，表明不同方法制得的核桃粕會对酱油品质产生重要影响。本研究对核桃粕的开发利用以及酱油原料的拓展起到一定的指导作用。

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