响应面法优化提取瓜蒌皮中总三萜的研究

曹 婧 胡煜璇 范杰平※

（1.江西中医药高等专科学校药学系，江西 抚州 344000；2.南昌大学资源环境与化工学院， 江西 南昌 330031）

瓜蒌（Trichosanthis frucutus）为葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowiiMaxim）的干燥成熟果实，又被称为全瓜蒌。2015 版《中华人民共和国药典》［1］记载瓜蒌的功效为润肺化痰、润肠通便，用于燥咳痰黏、肠燥便秘。现代药理学研究［2，3］表明，瓜蒌对肿瘤细胞具有抑制作用。瓜蒌中含有大量的萜类化合物，主要属于三萜类化合物。目前国内外大部分研究都是从瓜蒌子中提取，而对瓜蒌皮中的三萜皂苷研究不多［4-8］。本实验以瓜蒌皮中总三萜为对象，采用乙醇冷凝回流提取的方式，通过响应面分析法对工艺进行优化，对拟合数学模型进行描述，为总三萜的进一步开发和利用提供科学依据。

1 实验器材

1.1 主要仪器 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FZ102粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；磁力搅拌器（郑州杜甫仪器厂）。

1.2 原材料 瓜蒌皮（江西樟树天齐堂中药饮片有限公司）。

1.3 主要试剂 齐墩果酸标准品（南京清韵生物科技有限公司）；香草醛、冰乙酸、高氯酸、甲醇、乙醇等试剂为国产分析纯，实验室用水为一次蒸馏水。

2 实验方法

2.1 瓜蒌粉末的准备 采用高速多功能粉碎机将瓜蒌皮干燥饮片粉碎，并过40目筛，筛成细粉，装入密封塑料袋，贴上标签，备用。

2.2 标准曲线方程 以齐墩果酸标准品为对照，精密称取7.5 mg 齐墩果酸对照品，用甲醇溶解，定容在25 mL的容量瓶中，配制成0.3 mg/mL 的母液。分别精密量取齐墩果酸母液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 至10 mL容量瓶中，水浴锅中挥干甲醇；各自加入1.6 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液与3.2 mL 的高氯酸，60 ℃恒温水浴锅中加热20 min；取出冷却后，用冰醋酸稀释至刻度，再用紫外分光光度法于548 nm 波长处测量吸光度，得到齐墩果酸标准曲线方程。

2.3 总三萜的提取及测定方法 精密称取规定量的瓜蒌粉，加入规定体积和浓度的乙醇，在规定温度的水浴锅中冷凝回流规定时间；抽滤，滤液冷却后倒入100 mL 容量瓶，并加入对应浓度的乙醇溶液定容至刻度。分别从各组单因素实验得到的样品溶液中精密移取0.4 mL 于10 mL 容量瓶中，水浴锅中挥干溶剂；再各自加入1.6 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液与3.2 mL 的高氯酸，60 ℃恒温水浴锅中加热20 min；取出冷却后，用冰醋酸稀释至刻度，用紫外分光光度法在548 nm 波长处测量吸光度。再用线性回归方程计算相应的提取率。

2.4 总三萜提取率的计算 总三萜提取率=产品中总三萜的含量（g）/瓜蒌粉试样的重量（g）×100%。

3 结果与分析

3.1 标准曲线 根据不同齐墩果酸浓度对应的吸光度，计算得到的线性回归方程为A=58.505C-0.1986，R²=0.9966，线性范围为0.06～0.21 mg。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 回流时间对提取率的影响 按照实验方法2.3 项，精密称取1 g 瓜蒌粉置于100 mL 圆底烧瓶，加入40 mL的50%乙醇溶液，于70 ℃水浴锅中冷凝回流，改变提取时间。实验结果见图1。

图1 回流时间对提取率的影响

从图上看，最佳回流提取的时间为70 min。因曲线过于平缓，各回流时间下的提取率相差不大，因此直接选取70 min 进行之后的实验，不参与响应面的单因素分析。

3.2.2 乙醇浓度对提取率的影响 按照实验方法2.3 项，精密称取1 g 瓜蒌粉，置于100 mL 圆底烧瓶，分别加入60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液40 mL，在70 ℃水浴锅中冷凝回流提取70 min，实验结果见图2。

图2 乙醇浓度对提取率的影响

随着乙醇浓度的升高，提取率先变化不明显，然后在80%～90%范围内呈明显上升趋势，当乙醇浓度达到90%时提取率最高，三萜类物质的溶解度达到最大；之后提取率下降。推测是由于90%乙醇溶液的极性与三萜皂苷的极性相似，提取率明显增大。

3.2.3 液固比对提取率的影响 按照实验方法2.3 项，精密称取1 g瓜蒌粉，置于100 mL圆底烧瓶，90%的乙醇改变液固比，70 ℃水浴锅冷凝回流提取70 min。实验结果见图3。

图3 液固比对提取率的影响

从图上看，随着液固比的增加，总三萜提取率呈现由低到高并趋于稳定的趋势。推测是溶剂的增加使物料与溶剂的接触面增大，有利于扩散速度的提高。当液固比达到70 mL/g 时提取率最大，但与60 mL/g 的提取率相差不大，考虑到经济因素，选择60 mL/g 作为最佳液固比。

3.2.4 提取温度对提取率的影响 按照实验方法2.3项，精密称取1 g 瓜蒌粉，加入60 mL 的90%乙醇溶液，在不同温度下冷凝回流提取70 min。实验结果见图4。

图4 提取温度对提取率的影响

随着温度的升高，提取率增加，并呈缓缓上升趋势；当温度达到80 ℃时提取率最大，超过80 ℃后略有下降。这是由于随着温度的升高，三萜皂苷类物质的扩散速率加快，溶解度也增大，提取率提高，但温度过高会造成水浴锅中挥干甲醇物质易被破坏，而使提取率下降，并且也会使后续操作更为困难。因此提取时温度选择80 ℃为宜。

3.3 响应面法优化提取总三萜 选取影响提取过程较大的3 个因素：乙醇浓度、液固比和提取温度为自变量，精密称取1 g 瓜蒌粉，置于100 mL 圆底烧瓶，选取乙醇浓度（A）、液固比（B）和提取温度（C）3 个因素在回流时间为70 min 的条件下进行Box-Behnken 响应面分析设计［9-11］，以提取率为指标优化提取条件。实验因素及其水平设计见表1。实验按随机化的原则进行，以减少随机误差。实验安排及结果见表2。

表1 自变量及其水平

表2 实验安排及结果

3.3.1 模型评价 以实验所得的总三萜提取率为响应值，借助Design-Expert Software，对三元二次方程进行拟合，便能够得到一个多项式回归方程，即：Y=2.25-0.14A-0.027B-0.028C+0.033AB-0.11AC-0.038BC-0.19A2-0.051B2-0.019C2。F值越大，P值越小，意味着该项越显著。

从表3 可以看出，回归模型的P值为0.0003＜0.001，具有极其显著性差异，表明本实验使用的模型具有统计学意义；失拟项的P值为0.0501，大于0.05，表明差异不显著，拟合程度较好，残差由随机误差引起，对实验结果基本无影响，这表明响应面法优化瓜蒌皮中总三萜类化合物的提取工艺是可行的。比较回归方程中的一次项系数，可以看出，对瓜蒌皮中总三萜提取率的影响因素大小顺序为：A（乙醇浓度）＞C（提取温度）＞B（液固比）。

表3 回归系数的显著性分析

通过对模型的拟合分析，得到最佳的总三萜提取条件，即乙醇浓度82.62%，液固比51.29 mL/g，温度90 ℃。为了方便实际操作，将提取条件调整为乙醇浓度83%，液固比51 mL/g，提取温度90 ℃。

3.3.2 响应面分析 3-D 曲面是回归方程的直观表达形式。考察拟合响应曲面的形状，分析乙醇浓度、提取温度和液固比对总三萜提取率的影响（结果见图5）。由实验可知对提取率影响最大的为乙醇浓度，图中等高线最为密集，倾斜度也最高，说明乙醇浓度与回流温度的交互作用最为显著，对提取率的影响程度更大。

图5 响应面图

3.3.3 最优条件及验证 以响应面法优化后得到的最优提取条件进行工艺验证实验，3 次实验测得的提取率分别 为2.336%、 2.310%、 2.327%， 平 均 值 为2.324%。Design-Expert 预测的提取率为2.320%，测定值与预测值的偏差为0.187%，数值很小，说明该模型的预测性很好。

4 结论

本研究是在单因素实验的基础上，采用响应面法优化乙醇提取瓜蒌皮中总三萜的工艺参数，再建立回归方程模型；从显著性上看差异具有统计学意义，预测性也很好，这说明响应面法优化瓜蒌皮中总三萜类化合物的提取工艺是可行、可靠的。本次实验最终得到的最佳冷凝回流提取条件为乙醇浓度83%，液固比51 mL/g，提取时间70 min，提取温度90 ℃；该条件下得到的总三萜最佳提取率为2.324%。三萜类化合物具有较高的医用和食用价值，该实验为瓜蒌皮中总三萜的进一步研究提供了一定的参考依据。